p38 MAPK-PPARγ/NF-κB信号通路在脑缺血预处理诱导的脑缺血耐受中的作用

摘要

目的:脑缺血性疾病已经成为影响人类健康的最重要的疾病之一。大量研究证实，预先给予脑组织一个短暂、不引起神经元损伤的缺血刺激可以提高神经元对后续损伤性缺血打击的耐受能力，这一现象称为脑缺血耐受，预先给与的短暂脑缺血刺激称为缺血预处理（cerebral ischemic preconditioning，CIP）。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPKs)信号通路是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是重要的细胞内信号传递途径，大量的研究证实，MAPKs信号通路参与脑缺血过程，并且可能与诱导脑缺血耐受有密切的关系。p38 MAPK作为MAPKs中的一种亚型，在诱导脑缺血耐受过程中发挥着重要的作用。p38 MAPK信号转导通路受到刺激被激活后，会使下游的转录因子发生磷酸化，从而参与细胞内多种生命活动。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor，PPARγ)及核转录因子-κB(Nuclear factorkappa B，NF-κB)均属于p38 MAPK的下游信号分子。PPARγ是由配体激活的转录因子之一，它参与机体内脂类物质的分化和代谢、能量转换、炎症反应等多种生理及病理生理过程。NF-κB在静息状态下与IκB形成复合体存在于胞浆中，当细胞受到刺激后，使IκB发生磷酸化并与NF-κB解离，使NF-κB激活，被激活的NF-κB参与到基因转录过程中。因此我们推测，CIP有可能通过p38 MAPK-PPARγ/NF-κB信号通路诱导脑缺血耐受。另外，我们前期的研究已经证实，使用p38 MAPK的特异性抑制剂SB203580、PPARγ的特异性拮抗剂GW9662和NF-κB的特异性拮抗剂BAY11-7082均可以阻断CIP诱导的脑缺血耐受作用。
　　反义寡聚脱氧核苷酸（antisense oligodeoxy-nucleotides，AS-ODNs）可以根据碱基互补原则结合目的基因，从而达到特异性的封闭目的基因和蛋白表达的目的。为进一步证实p38 MAPK-PPARγ/NF-κB信号通路在CIP诱导脑缺血耐受中的作用，本实验观察应用p38 MAPK AS-ODNs对CIP诱导的脑缺血耐受、以及在此过程中p38 MAPK-PPARγ/NF-κB信号通路蛋白表达的变化。
　　方法:
　　1、CIP诱导脑缺血耐受过程中p-p38 MAPK、PPARγ、NF-κB p50蛋白表达的变化
　　40只健康雄性Wistar大鼠(280～300 g)，首先永久凝闭椎动脉，恢复2天后，随机分为以下4组:①sham组(n=10):只暴露双侧颈总动脉，不其阻断血流;②CIP组(n=10):夹闭双侧颈总动脉3 min，然后恢复血流再灌注;③脑缺血损伤组(ischemic insult，Ⅱ)(n=10):夹闭双侧颈总动脉8 min，然后恢复血流再灌注;④CIP+Ⅱ组(n=10):先夹闭双侧颈总动脉3 min作为CIP，再灌注2天后，再次夹闭双侧颈总动脉8 min作为损伤性缺血处理，然后恢复血流再灌注。以上各组均sham手术后或末次脑缺血再灌注后6h和2d（每个时间点n=5）断头取脑，分离海马CA1区，应用Western blot方法观察p-p38 MAPK、PPARγ、NF-κB p50蛋白的表达。
　　2、p38 MAPK AS-ODNs对CIP诱导的PPARγ、NF-κB p50蛋白表达的影响
　　60只健康雄性Wistar大鼠(280～300 g)，首先永久凝闭椎动脉，恢复2天后，随机分为以下4组:①sham组(n=10);②CIP组(n=10);③p38 MAPK AS-ODNs+CIP组(n=30);④p38 MAPK S-ODNs+CIP组(n=10)。其中③组根据p38 MAPK AS-ODNs剂量不同，又分成5 noml、10 noml和15 noml3个亚组;④组中p38 MAPK S-ODNs剂量为15 noml。各（亚）组均分为6h、2d时间点（每个时间点n=5）。p38 MAPK AS-ODNs及p38 MAPK S-ODNs均溶于15μl人工脑脊液(Aritificial cerebrospinalfluid，ACSF)中，于凝闭锥动脉前1天开始注射，每天1次，连续注射5天，至CIP后1天结束（其中CIP6 h时间点大鼠只能注射4次）。在规定的时间点，断头取大鼠脑组织，应用Western blot方法观察大鼠海马CA1区CIP后PPARγ、NF-κB p50蛋白的表达。
　　3、p38 MAPK AS-ODNs对CIP诱导脑缺血耐受过程中大鼠海马CA1区PPARγ、NF-κB p50蛋白表达的影响
　　50只健康雄性Wistar大鼠(280～300 g)，首先永久凝闭椎动脉，恢复2天后，随机分为以下3组:①CIP+Ⅱ组(n=10);②p38 MAPK AS-ODNs+CIP+Ⅱ组(n=30);③p38 MAPK S-ODNs+CIP+Ⅱ组(n=10)。其中②组根据p38 MAPK AS-ODNs剂量不同，又分成5 noml、10 noml和15 noml3个亚组，③组中p38 MAPK S-ODNs剂量为15 noml。各（亚）组均分为6h和2d时间点（每个时间点n=5）。p38 MAPK AS-ODNs及p38 MAPK S-ODNs均溶于15μlACSF中，于凝闭锥动脉前1天开始注射，每天1次，连续注射5天，至CIP后1天结束。在规定的时间点，断头取大鼠脑组织，应用Western blot方法观察大鼠海马CA1区PPARγ、NF-κBp50蛋白的表达。
　　4、p38 MAPK AS-ODNs对CIP诱导的脑缺血耐受的影响
　　45只健康雄性Wistar大鼠(280～300 g)，首先永久凝闭椎动脉，恢复2天后，随机分为以下7组:①sham组(n=5);②CIP组(n=5);③Ⅱ组(n=5);④CIP+Ⅱ组(n=5);⑤ACSF+CIP+Ⅱ组(n=5);⑥p38MAPK AS-ODNs+CIP+Ⅱ组(n=15);⑦p38 MAPK S-ODNs+CIP+Ⅱ组(n=5)。p38 MAPK AS-ODNs及p38 MAPK S-ODNs均溶于15μl ACSF中，凝闭锥动脉前1天开始注射，至CIP后1天，共注射5次（每天1次，共5天），其余步骤同CIP+Ⅱ组。其中⑥组根据p38 MAPK AS-ODNs剂量不同，又分成5 noml、10 noml和15 noml3个亚组（各（亚）组n=5）。其中⑦组中p38 MAPK S-ODNs剂量为15 noml。所有大鼠均在sham手术之后或者末次全脑缺血/再灌注手术操作后7天，断头取出脑组织，应用硫堇染色观察大鼠海马CA1区神经元迟发性死亡的情况。
　　结果:
　　1、CIP诱导脑缺血耐受过程中p-p38 MAPK、PPARγ、NF-κBp50蛋白表达的变化
　　Western blot分析显示，在6h时间点，sham组大鼠海马CA1区有一定量的p-p38 MAPK蛋白、PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白的基础表达。与sham组相比，CIP使p-p38MAPK蛋白、PPARγ蛋白和NF-κBp50蛋白的表达均明显上调，分别为基础值的1.25倍、1.28倍和1.36倍(P＜0.05)。与sham组相比，Ⅱ打击引起了p-p38 MAPK蛋白、PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白的表达更为明显的上调，分别为基础值的1.64倍、1.74倍和2.02倍(P＜0.01)。预先给与CIP，可明显抑制Ⅱ打击引起的p-p38MAPK、PPARγ和NF-κB p50蛋白的表达的过度上调，表现为与Ⅱ组相比， CIP+Ⅱ组的p-p38 MAPK、PPARγ和NF-κB p50蛋白的表达均明显下降(P＜0.05)。在2d时间点，各组中p-p38 MAPK、PPARγ和NF-κB p50蛋白表达的变化趋势与6h时间点一致。结果表明CIP引起p-p38 MAPK、PPARγ和NF-κB p50蛋白表达显著升高，并可抑制缺血打击引起的这些蛋白表达的过度上调。
　　2、p38 MAPK AS-ODNs对CIP诱导的PPARγ、NF-κB p50蛋白表达的影响
　　Western blot分析显示，在6h时间点，sham组大鼠海马CA1区有一定量的PPARγ蛋白和NF-B p50蛋白的基础表达。与sham组相比，CIP组使PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白的表达均明显上调(P＜0.05)。在p38MAPK AS-ODNs+CIP组中，PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白的表达均明显降低，且随着p38 MAPK AS-ODNs剂量的增大，PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白的表达呈剂量依赖性降低。p38 MAPK S-ODNs+CIP组与CIP组相比，PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白的表达无明显变化(P＞0.05)。在2d时间点，各组中PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白表达的变化趋势同6h时间点一致。结果表明p38 MAPK AS-ODNs剂量依赖性地阻断CIP后PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白表达的上调。
　　3、p38 MAPK AS-ODNs对CIP诱导脑缺血耐受过程中大鼠海马CA1区PPARγ、NF-κB p50蛋白表达的影响
　　Western blot分析显示，在6h时间点，与CIP+Ⅱ组相比，p38 MAPKAS-ODNs+CIP+Ⅱ组PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白的表达均明显降低，且随着p38 MAPK AS-ODNs剂量的增大，PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白的表达呈剂量依赖性降低;p38 MAPK S-ODNs+CIP+Ⅱ组PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白的表达无明显变化(P＞0.05)。在2d时间点，各组中PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白表达的变化趋势同6h时间点一致。结果表明p38MAPK AS-ODNs剂量依赖性地阻断CIP诱导脑缺血耐受过程中PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白表达的上调。
　　4、p38 MAPK AS-ODNs对CIP诱导的脑缺血耐受的影响
　　在Sham组、CIP组中，大鼠海马CA1区神经元致密有序的排列、共2～3层，胞核饱满，核仁清晰，均未见神经元受损，组织学的分级为0级，ND值分别为196.12±6.93和182.67±10.07。同sham组相比，Ⅱ组出现了较明显的迟发性的神经元死亡，神经元的密度明显下降，组织学的分级为Ⅱ～Ⅲ级，ND值为17.33+6.11，显著降低(P＜0.01)。在CIP+Ⅱ组与Ⅱ组相比，神经元的存活状态有明显改善，即CIP可显著抑制脑缺血损伤引起的迟发性神经元死亡，ND值为178.67±6.11，明显增高(P＜0.01)。ACSF+CIP+Ⅱ组与CIP+Ⅱ组相比，神经元的存活状态没有发生改变，即注射脑脊液对神经元的存活状态无影响，ND值为178.78+7.03，无差异(P＞0.05)。与ACSF+ CIP+Ⅱ组相比，p38 MAPK AS-ODNs+CIP+Ⅱ组出现了显著的迟发性神经元死亡，表现为组织学分级升高，锥体神经元密度降低，且此种变化与p38 MAPK AS-ODNs的注射剂量呈明显正相关。在p38MAPK S-ODNs+CIP+Ⅱ组中，海马CA1区锥体神经元存活状态良好，未见锥体神经元受损，ND值为174.20+13.61，与ACSF+CIP+Ⅱ组相比无差异(P＞0.05)。结果表明p38 MAPK AS-ODNs剂量依赖性地阻断CIP所诱导的脑缺血耐受。
　　结论:p38 MAPK-PPARγ/NF-κB信号通路参与CIP诱导的脑缺血耐受。

目录

声明

摘要

前言

材料和方法

1、主要实验仪器

2、主要试剂和药品

3、实验动物与分组

4、实验方法

5、统计学处理

结果

1、CIP诱导脑缺血耐受过程中，大鼠海马CA1区p-p38 MAPK蛋白、PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白表达的变化

2、p38 MAPK AS-ODNs对CIP后大鼠海马CA1区PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白表达的影响

3、p38 MAPK AS-ODNs对CIP诱导脑缺血耐受过程中大鼠海马CA1区PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白表达的影响

4、p38 MAPK AS-ODNs对CIP诱导的脑缺血耐受的影响

附图

讨论

结论

参考文献

综述 NF-κB介导的炎症基因的转录调控

致谢

个人简历