一种柿叶中提高脑缺血耐受作用的提取物

摘要

本发明涉及一种柿叶中提高脑缺血耐受作用的提取物，可有效解决提高脑缺血耐受作用的问题。本发明解决的技术方案是，该提取物为柿叶提取物，是将柿叶粉碎成粗粉，加入柿叶粗粉重量的8-10倍量的质量浓度为70％的乙醇，浸泡30min后，回流提取1h；过滤，药渣再加柿叶粗粉重量的6-8倍的质量浓度为70％的乙醇，回流提取1h过滤，合并两次滤液，回收乙醇后，用NaOH调pH至13，3000r/min离心15min，得柿叶提取物，或称取柿叶粗粉，用超临界CO

说明书

一、技术领域

本发明涉及医药，特别是一种柿叶中提高脑缺血耐受作用的提取物。

二、背景技术

柿树属柿树科(Ebenaceae)柿树属(Diospyros)植物柿(Diospyros kaki L..f)植物，是我国南北各地普遍栽培的食用品种。柿果、柿核、柿蒂、柿霜、柿漆、柿饼、柿树心木、柿花、柿叶、柿子皮、柿木皮及柿根皮等均可作为药用或有可能成为药物。在我国柿叶资源特别丰富，使用方便，医用疗效确切，正日益受到人们的重视，柿的新鲜或干燥叶，其入药始见于明《滇南本草》记载“经霜叶敷臃疮”。柿叶中含有丰富的营养物质和功效成分，具有抗菌消炎、生津止渴、清热解毒、润肺强心、镇咳止血、抗癌防癌等多种保健功能，而且柿叶产品食用安全无毒，故柿叶的开发利用前景广阔。

现代研究表明：柿叶含有以萘为骨架的芳香化合物(萘醌类、萘酚类)，苯并吡喃酮类(黄酮类、花色素类、香豆素类)，萜类(主要是三萜化合物且都是五环三萜化合物)，谷甾醇类，脂肪酸，鞣质，柿叶中含有大量的维生素C、E和有机酸类等。柿叶有好的改善心脑血管功能作用。柿叶具有止血作用；柿叶提取液有抗菌、解热作用；柿叶具有明显的抗氧化作用；柿叶具有明显的减肥降脂作用；柿叶有抗癌变和抗诱变作用，调节免疫功能作用。柿叶粉能显著降低食用高固醇食物小鼠肝脏中的胆固醇浓度，增加胆汁酸的排泄。

临床上柿叶有软化血管和预防动脉硬化的作用，用于治疗心脑血管疾病；应用柿叶可治疗多种出血症；柿叶具有抗菌消炎、解热作用；柿叶有预防贫血、降脂减肥和美容的作用；有抗癌和抗诱变作用；柿叶复方对妇女某些疾病如痛经有效，柿叶茶对患者的精神状态和食欲有好。柿叶有清血利尿、治疗烧伤和褥疮的作用。

脑缺血耐受现象[1](Brain ischemic tolerance，BIT)是指预先短暂性缺血或轻度缺氧激发或动员机体内在的防护能力，使机体对随后严重的缺血、缺氧产生防御和保护作用的现象。脑缺血耐受现象最初在研究心肌缺血时发现，脑、骨骼肌、肝、肾、小肠等器官中也发现了类似现象。现认为脑缺血耐受的机制主要有兴奋性氨基酸(EAA)、炎症、热休克蛋白(HSP)、腺苷、细胞凋亡、反应性星形细胞增生和信号传导通路。药物(腺苷、3-硝基丙酸(3-NPA)、某些抗生素、麻醉药物、阿司匹林、内毒素、缓激肽、神经营养因子等)对脑缺血耐受的提高作用，但因多方原因，上述药物在脑缺血耐受中应用受到了制约。祖国医学没有脑缺血耐受的明确提法，但祖国医学对脑缺血辨证清楚，脑缺血属于中医“缺血中风”的范畴。缺血中风的发生主要与风、火、痰、淤、虚等因素有关，而与“淤”关系最为密切，“活血化淤”可是提高脑缺血耐受的基本方法。那么如何利用中医药大宝库来解决提高脑缺血耐受作用呢？至今未见有公开报导。

三、发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种柿叶中提高脑缺血耐受作用的提取物，可有效解决提高脑缺血耐受作用的问题。

本发明解决的技术方案是，该提取物为柿叶提取物，是将柿叶粉碎成粗粉，加入柿叶粗粉重量的8-10倍量的质量浓度为70％的乙醇，浸泡30min后，回流提取1h；过滤，药渣再加柿叶粗粉重量的6-8倍的质量浓度为70％的乙醇，回流提取1h过滤，合并两次滤液，回收乙醇后，用NaOH调pH至13，3000r/min离心15min，得柿叶提取物，或称取柿叶粗粉，用超临界CO₂萃取法，萃取压力为30.0mPa，萃取温度50℃，CO₂流量30Kg/h，萃取3h，得柿叶提取物。

本发明提取物有效用于制备治疗提高脑缺血耐受作用的药物。制备方法简单，原材料丰富，成本低，效果好，开拓了柿叶的药用价值，是中药上的创新。

四、具体实施方式

以下结合实施例，对本发明的具体实施方式做详细说明。

实施例1，本发明在具体实施时，是由柿叶经粉碎机粉碎过30目筛成柿叶粗粉，然后，取柿叶粗粉100克加入柿叶粗粉重量十倍量的质量浓度为70％乙醇1000克，浸泡30分钟，回流提取1小时，过滤得滤液；药渣再加入柿叶粗粉重量8倍的质量浓度为70％的乙醇800g，回流提取1小时，过滤得滤液，合并两次滤液，回收乙醇后，用NaOH调pH值为13，3000r/min离心15min，得柿叶提取物。

实施例2，本发明在具体实施中，还可由以下实现：将柿叶经粉碎机粉碎过50目筛，成柿叶粗粉然后，取柿叶粗粉50克加入柿叶粗粉重量8倍量的质量浓度为70％乙醇400克，浸泡30分钟，回流提取1小时，过滤得滤液；药渣再加入柿叶粗粉重量6倍的质量浓度为70％的乙醇300g，回流提取1小时，过滤得滤液，合并两次滤液，回收乙醇后，用NaOH调pH值为13，3000r/min离心15min，得柿叶提取物。

实施例3，本发明在具体实施中，还可由以下实现：将柿叶经粉碎机粉碎成粗粉，然后，取柿叶粗粉80克加入柿叶粗粉重量9倍量的质量浓度为70％乙醇720克，浸泡30分钟，回流提取1小时，过滤得滤液；药渣再加入柿叶粗粉重量7倍的质量浓度为70％的乙醇560g，回流提取1小时，过滤得滤液，合并两次滤液，回收乙醇后，用NaOH调pH值为13，3000r/min离心15min，得柿叶提取物。

实施例4，本发明在具体实施中，也可由以下具体方案实现：将柿叶经粉碎机粉碎成粗粉，取粗粉100g，置入超临界萃取釜中，用超临界CO₂萃取法，萃取压力为30.0mPa，温度50℃，CO₂流量30Kg/h，萃取3h，得柿叶提取物。

本发明提取物可有效用于制备治疗提高脑缺血耐受作用的药物，对于提高脑缺血耐受作用经试验得到了充分的证明，有关试验资料如下：

对小鼠脑缺血耐受模型的影响

1实验材料

1.1试剂药品

本发明柿叶提取物：称取柿叶粗粉，加8-10倍量的70％乙醇，浸泡30min后回流提取1h；过滤，药渣再加6-8倍量的70％乙醇，回流提取1h过滤。合并两次滤液，回收乙醇后用NaOH调pH至13，离心(3000r/min)15min，得柿叶提取物。或称取柿叶粗粉，采用超临界CO2萃取法，萃取压力为30.0mPa，萃取温度50℃，CO₂流量30Kg·h^-1，萃取时间3h，得柿叶提取物。

银杏叶提取物片(金纳多)，德国威玛舒博士药厂，批号9900908；水合氯醛，天津市科密欧化学试剂开发中心，批号20071018；医用酒精，郑州晟弘工贸有限公司，批号20090801；氯化钠注射液，郑州永和制药有限公司，批号09073105；碘[¹²⁵I]6-酮-前列腺素-F₁α内皮素，北京普尔伟业生物科技有限公司解放军总医院科技开发中心放免所，批号20091125；碘[¹²⁵I]血栓烷素B₂放射免疫分析药盒，北京普尔伟业生物科技有限公司解放军总医院科技开发中心放免所，批号20091125；纤溶酶原激活剂(t-PA)含量测定试剂盒(酶联免疫法)，上海太阳生物技术有限公司，批号41130；纤溶酶原激活剂抑制物-1(PAI-1)含量测定试剂盒(酶联免疫法)，上海生物科技有限公司，批号42135。

1.2实验仪器

JT6001电子天平，上海精天电子仪器厂；1202080019电子分析天平，奥豪斯(上海)公司；KDC-160HR高速冷冻离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司；酶免仪，680MicroplateReader，Bio-Rad Laboratories；SN-695B型智能放免γ测量仪，上海原子核研究所日环仪器一厂。

1.3实验动物

清洁级小鼠，昆明种，雄性，体重25～30g；由河北省实验动物中心所提供，合格证编号911137。

2.实验方法

2.1造模与给药

取小鼠126只，随机均匀分为7组，分别为假手术组、缺血再灌注组、预处理模型组、柿叶醇提物高剂量组、柿叶醇提物中剂量组、柿叶醇提物低剂量组、银杏叶提取物组。所有小鼠经10％水合氯醛(0.03ml/10g)腹腔注射麻醉，仰固定于手术台上，颈前正中切口，钝性分离双侧颈总动脉。除假手术组、缺血再灌注组外，其余各组小鼠用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉，分别阻断血流10min，然后恢复灌流；假手术组、缺血再灌注组只暴露双侧颈总动脉，但不阻断血流。动物手术苏醒后，各给药组分别给予高剂量柿叶醇提物(400mg/kg)、中剂量柿叶醇提物(200mg/kg)、低剂量柿叶醇提物(100mg/kg)、银杏叶提取物片(40mg/kg)，假手术组、缺血再灌注组及预处理模型组灌同体积的生理盐水，所有小鼠的灌药体积是0.1ml/10g，每天给药1次，连续给药5天。于第5天禁食12h给药后1h，所有小鼠经10％水合氯醛(0.03ml/10g)腹腔注射麻醉，仰位固定于手术台上，颈前正中切口，钝性分离双侧颈总动脉，除假手术组外，其余小鼠均用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉，分别阻断血流30min，然后恢复灌流；假手术组只暴露双侧颈总动脉，不阻断血流。术中维持环境温度24±1℃。实验过程中死亡33只小鼠，各组小鼠情况见结果。

2.2观察项目及检测方法

所有小鼠于末次手术后24h取血，枸橼酸钠抗凝，分离血浆，采用酶联免疫法测定纤溶酶原激活剂(t-PA)含量、纤溶酶原激活剂抑制物-1(PAI-1)含量；取血后处死，迅速剥取脑组织，冠状切取做HE染色，切取皮层组织15mg，采用放射免疫法测定6-酮-前列腺素-F₁α、血栓烷素B₂含量。

2.2.1纤溶酶原激活剂含量的测定方法

检验原理：采用酶联免疫吸附双抗体夹心法原理定量测定组织纤溶酶原激活剂水平。包被人t-PA抗体与待测样本中的t-PA结合，加入酶标抗体形成复合物，后者与底物作用呈现显色反应。490nm处测得的A值与待测样本t-PA含量成正比。

操作程序：①试剂重建浓稀释液用前置于37℃水浴15min，振摇均匀(因为母液盐浓度高，冰箱保存易结冰析出)，然后用蒸馏水做10倍稀释(1ml浓稀释液+9ml蒸馏水)。浓洗涤液用前置于37℃水浴15min，振摇均匀(因为母液盐浓度高，冰箱保存易结冰析出)，然后用蒸馏水做20倍稀释(1ml浓稀释液+19ml蒸馏水)。将每瓶校准品用1.8ml稀释液准确复溶(60ng/ml)。取250μl，用稀释液作四倍比稀释，得浓度为60、30、15、7.5、3.75ngml五个标准点。②加样每孔加不同浓度校准品或待测样本100μl，空白对照孔加入稀释液100μl，37℃孵育150分钟。③洗涤弃去反应孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置3秒钟，甩干，反复三次后拍干。④加酶标抗体每孔加入酶标抗体100μl，37℃孵育60分钟。⑤洗涤弃去反应孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置3秒钟，甩干，反复三次后拍干。⑥显色临用前每片OPD用5ml底物缓冲液溶解。每孔加底物液100μl，37℃孵育15分钟。⑦终止每孔加终止液50μl。⑧比色在酶标仪上490nm处，以空白对照空调零，测定各孔A值。⑨数据处理以A₄₉₀对t-PA校准品浓度(ng/ml)在普通坐标系上作标准曲线，待测样本t-PA含量(ng/ml)可以从标准曲线上查出。

2.2.2纤溶酶原激活剂抑制物-1含量的测定方法

检验原理：采用酶联免疫吸附双抗体夹心法原理定量测定纤溶酶原激活剂抑制物-1水平。包被人PAI-1抗体与待测样本中的PAI-1结合，加入酶标抗体形成复合物，后者与底物作用呈现显色反应。490nm处测得的A值与待测样本PAI-1含量成正比。

操作程序：①试剂重建浓稀释液用前置于37℃水浴15min，振摇均匀(因为母液盐浓度高，冰箱保存易结冰析出)，然后用蒸馏水做10倍稀释(1ml浓稀释液+9ml蒸馏水)。浓洗涤液用前置于37℃水浴15min，振摇均匀(因为母液盐浓度高，冰箱保存易结冰析出)，然后用蒸馏水做20倍稀释(1ml浓稀释液+19ml蒸馏水)。将每瓶校准品用0.5ml稀释液准确复溶(120ng/ml)。取250μl，用稀释液作六倍比稀释，得浓度为120、60、30、15、7.5、3.75、1.875ngml七个标准点。②加样每孔加不同浓度校准品或待测样本100μl，空白对照孔加入稀释液100μl，37℃孵育150分钟。③洗涤弃去反应孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置3秒钟，甩干，反复三次后拍干。④加酶标抗体每孔加入酶标抗体100μl，37℃孵育60分钟。⑤洗涤弃去反应孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置3秒钟，甩干，反复三次后拍干。⑥显色临用前每片OPD用5ml底物缓冲液溶解。每孔加底物液100μl，37℃孵育15。⑦终止每孔加终止液50μl。⑧比色在酶标仪上490nm处，以空白对照空调零，测定各孔A值。⑨数据处理以A₄₉₀对PAI-1校准品浓度(ng/ml)在普通坐标系上作标准曲线，待测样本PAI-1含量(ng/ml)可以从标准曲线上查出。

2.2.3血栓烷B₂的测定方法

测定原理：利用液相竞争抑制原理，采用平衡法对样品进行测定。待测样本或标准品与限量的抗血清及标记抗原加在一起进行竞争性结合反应，反应完全后，加入免疫分离剂，分离出抗原-抗体复合物，测定复合物的放射性(B)，计算各标准管的结合率(B/B0％)。

校准试剂：缓冲液A，1瓶(液体)；缓冲液B，1瓶(蓝色，液体)；抗血清：1瓶(白色，冻干粉)；标准品：1支(白色，冻干粉)，浓度为浓度为20，60，180，500，1000pg/ml；¹²⁵I-TXB₂：1瓶(白色，冻干粉)；PR分离剂：1瓶(液体)，使用前充分摇匀。

操作程序：本实验采用平衡法，取聚乙烯试管编号，按下表程序操作：

TXB₂RIA加液程序(μl)

数据处理：以γ计数仪预先编制的程序直接给出有关参数、校准曲线及样品浓度。

2.2.46-酮-前列腺素F₁α的测定方法

测定原理：利用液相竞争抑制原理，采用平衡法对样品进行测定。待测样本或标准品与限量的抗血清加在一起反应一段时间后，再加入及标记抗原进行竞争性结合反应，反应完全后，加入免疫分离剂，分离出抗原-抗体复合物，测定复合物的放射性(B)，计算各标准管的结合率(B/B0％)。

校准试剂：缓冲液A，1瓶(液体)；缓冲液B，1瓶(红色，液体)；抗血清：1瓶(白色，冻干粉)；标准品：1支(白色，冻干粉)，浓度为浓度为20，60，180，500，1000pg/ml；¹²⁵I-6-Keto-PGF₁α：1瓶(白色，冻干粉)；PR分离剂：1瓶(液体)，使用前充分摇匀。

操作程序：本实验采用非衡法，取聚乙烯试管编号，按下表程序操作：

6-Keto-PGF₁αRIA加液程序(μl)

数据处理：以γ计数仪预先编制的程序直接给出有关参数、校准曲线及样品浓度。

3.实验结果

3.1对脑缺血耐受小鼠血浆t-PA、PAI-1水平的影响

结果见表1。

表1柿叶醇提物对脑缺血耐受小鼠血浆t-PA、PAI-1水平的影响

注：与假手术组比较^△△P＜0.01，^△P＜0.05；与缺血再灌注组比较^▲▲P＜0.01，^▲P＜0.05；与模型组比较^**P＜0.01，^*P＜0.05

上表可看出，与假手术组相比，缺血再灌注组和预处理模型组小鼠血浆t-PA浓度、PAI-1浓度有显著的统计意义(P＜0.01)；与缺血再灌注组比较，预处理模型组小鼠血浆t-PA浓度、PAI-A浓度有明显差异(P＜0.05)，说明缺血预处理可以对再次发生的严重脑缺血产生耐受性，造模成功。与预处理模型组相比，柿叶醇提物低剂量组小鼠血浆t-PA浓度、PAI-1浓度没有统计学意义(P＞0.05)，柿叶醇提物中、高剂量组，阳性对照组小鼠血浆t-PA浓度差异显著(P＜0.01)，柿叶醇提物中剂量组小鼠血浆PAI-1浓度差异明显(P＜0.05)，柿叶醇提物高剂量组、银杏叶提取物组小鼠血浆PAI-1浓度差异显著(P＜0.01)。

结果提示：根据上述数理统计分析，本次实验动物预处理模型组与缺血再灌注组相比较，缺血再灌注组的损伤要重，用药各组均具有不同程度增强脑细胞耐缺血的作用，柿叶醇提物高剂量组、银杏叶提取物组作用最好，其次为柿叶醇提物中剂量组，柿叶醇提物低剂量组虽无统计学意义，但在一定程度上提高了脑缺血耐受作用。

3.2对脑缺血耐受小鼠大脑皮层匀浆TXB₂、6-Keto-PGF₁α及TXB₂/6-Keto-PGF₁α水平的影响结果见表2。

表2柿叶醇提物对脑缺血耐受小鼠大脑

皮层匀浆TXB₂、6-Keto-PGF₁α水平的影响

注：与假手术组比较^△△P＜0.01，^△P＜0.05；与缺血损伤组比较^▲▲P＜0.01，^▲P＜0.01；与模型组比较^**P＜0.01，^*P＜0.05

表3柿叶醇提物对脑缺血耐受小鼠大脑皮层

TXB₂/6-Keto-PGF₁α水平的影响

注：与假手术组比较^△△P＜0.01，^△P＜0.05；与缺血损伤组比较^▲▲P＜0.01，^▲P＜0.01；与模型组比较^**P＜0.01，^*P＜0.05

由上表可直观看出，与假手术组相比，缺血再灌注组和预处理模型组小鼠大脑皮层6-Keto-PGF₁α、TXB₂含量及TXB₂/6-Keto-PGF₁α有显著的统计意义(P＜0.01)；与缺血再灌注组比较，模型对照组小鼠血大脑皮层6-酮-前列腺素-F₁α、血栓烷素B₂含量及TXB₂/6-Keto-PGF₁α差异显著(P＜0.01)，说明缺血预处理可以对再次发生的严重脑缺血产生耐受性，造模成功。与模型对照组相比，柿叶醇提物低、中、高剂量组，阳性对照组小鼠大脑皮层6-酮-前列腺素-F₁α、血栓烷素B₂含量及TXB₂/6-Keto-PGF₁α差异显著(P＜0.01)。

结果提示：根据上述数理统计分析，本次实验动物脑缺血耐受预处理模型组与缺血再灌注组相比较，缺血再灌注组的损伤要重，用药各组均具有能够减轻脑缺血再灌注造成的损伤，提高了脑耐缺血的发生。

3.3对小鼠脑缺血耐受模型脑组织的协同保护作用结果见表4。

表4柿叶醇提物对小鼠脑缺血耐受模型脑组织的协同保护作用

根据实验动物脑神经细胞出现不同的病理改变可将分为四级：“-”脑神经细胞体大、胞浆丰富、细胞核均正常；“+”少部分脑神经细胞体积缩小，胞浆减少，细胞核基本正常；“++”部分脑神经细胞萎缩，胞浆减少、细胞核淡染或消失；“+++”大部分实验动物脑神经细胞明显萎缩，胞浆明显减少、细胞核模糊不清或消失。

假手术组动物脑神经细胞、细胞膜、核仁清晰可见；缺血再灌注组动物脑神经细胞可见细胞明显肿胀、细胞体积增大，或出现固缩，胞浆、细胞核蓝染现象；预处理模型组脑神经细胞可见部分细胞肿胀、核淡染现象；柿叶醇提物低剂量组动物脑神经细胞可见部分细胞肿胀、核淡染现象；柿叶醇提物中剂量组动物脑神经细胞可见少部分细胞肿胀、核淡染现象；柿叶醇提物高剂量组动物脑神经细胞可见个别细胞肿胀、核淡染现象；银杏叶提取物组动物神经细胞可见个别细胞肿胀、核淡染现象。

经秩和检验，与假手术组比，缺血再灌注组和预处理模型组有显著的统计意义(P＜0.01)；与缺血再灌注组比较，预处理模型组有明显差异(P＜0.05)。与预处理模型组相比，柿叶醇提物低、中剂量组有明显差异(P＜0.05)，柿叶醇提物高剂量组、银杏叶提取物组有显著差异(P＜0.01)。

结果提示：根据病理观察结果及上述数理统计分析，本次实验动物脑缺血耐受预处理模型组与缺血再灌注组相比较，缺血再灌注组的病理改变要重，脑神经细胞明显萎缩，胞浆明显减少、细胞核模淡染、糊不清或消失；用药各组均具有不同增强脑细胞耐缺血的作用，柿叶醇提物高剂量组及银杏叶提取物组作用最好，其次为柿叶醇提物中、低剂量组。

4结论

上述试验经多次(两年进行了12次)，均取得了相同或相近似的结果，这充分表明柿叶醇提物能够明显升高脑缺血模型小鼠血浆中t-PA含量，降低PAI-1含量，说明柿叶醇提物可以很好的改善脑组织纤溶系统功能；升高小鼠大脑皮层6-Keto-PGF₁α含量、降低TXB₂含量。柿叶醇提物有好的脑缺血耐受协同作用。