微骨折技术联合富血小板血浆对兔膝关节软骨损伤修复作用的实验研究

摘要

目的:由于关节软骨自身无血管淋巴管及神经分布，损伤后很难自身修复。如何处理膝关节软骨全层损伤是骨科领域的一大难题。目前临床有多种关节软骨修复的手术方法:组织移植术和细胞移植术等新兴技术，仅在试验阶段，因其操作复杂，价格昂贵，目前还难以在临床广泛开展;微骨折技术(microfracture，MF)通过刺激未分化的骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞，最终修复软骨缺损;富血小板血浆(platelet rich plasma，PRP)通过浓集的生长因子促进细胞活化、增殖等参与损伤组织的愈合。由于后两者可以提供类似组织工程的种子细胞及生长因子，而且操作简单，因此微骨折技术结合富血小板血浆治疗软骨损伤是很有前景的研究方向，但目前关于其研究的报道甚少。
　　本实验旨在观察不同时间、微骨折技术、自体富血小板血浆以及应用微骨折技术联合富血小板血浆对膝关节软骨全层缺损进行修复的组织学变化，以探讨采用微骨折技术联合富血小板血浆治疗关节软骨缺损的疗效，从而为临床工作提供实验理论依据及指导意见。
　　方法:
　　1、实验分组及模型制备:新西兰大白兔48只，进行随机分组，为A、B、C、D四组每组各12只。于兔右膝股骨内侧髁负重区建立全层软骨缺损的模型。A组:软骨缺损区不予处理;B组:关节内注射自体富血小板血浆;C组:软骨缺损区行微骨折术;D组:软骨缺损区行微骨折术并在膝关节内注射自体富血小板血浆。
　　2、采血:B与D组均于兔耳缘静脉取7-9ml静脉血，其中5ml注入肝素锂抗凝的真空采血管中，2 ml注入EDTA-K2抗凝真空采血管中，已备用。
　　3、自体PRP的制备:当中5ml静脉血进行二次离心，即第一次离心以2000r/min，离心10min，第二次离心转速时间均同上，制备PRP约0.5ml，术中注射关节腔内。
　　4、血小板计数:将EDTA-K2抗凝真空采血管中2ml静脉血放入血细胞分析仪中进行血小板计数，然后同样二次离心制备PRP，再将PRP进行血小板计数，验证制备出的PRP是否符合实验要求。
　　5、观察指标:术后8、12周每组随机处死6只实验动物，其中随机5只切开暴露右膝，对其进行大体观察并对其进行大体评价，随后对损伤修复部位标本进行取材制成组织切片并行HE和甲苯胺蓝染色，另一组织标本行电镜(scanning electron microscope，SEM)制片。组织学制片完成后分别对标本行光镜和电镜观察各组并对其进行相应组织学评价。
　　结果:
　　1、大体观察:术后8周:A组:缺损区修复组织未能平整修复软骨缺损，缺损区与周边正常软骨边界清晰;B组:缺损区修复组织修复软骨缺损较平整，缺损区与周边正常软骨边界较模糊;C组:缺损区修复组织修复软骨缺损较平整，缺损区与周边正常软骨边界较模糊;D组:缺损区修复组织修复软骨缺损较平整，缺损区与周边正常软骨边界模糊。术后12周:A组:缺损区修复组织未能平整修复软骨缺损，缺损区仍可见明显凹凸不平;B组:缺损区修复组织未能平整的修复软骨缺损，修复区与周边正常软骨边界清晰;C组:缺损区修复组织修复软骨缺损较平整，修复区与周边正常软骨边界较清晰;D组:缺损区修复组织平整修复软骨缺损，修复区与周边正常软骨边界迷糊，与周围的软骨色泽相近。
　　2、组织学观察:术后8周:A组显微镜下观察可见软骨缺损区与正常软骨区边界明显存在较大裂隙，新生细胞排列紊乱;B组显微镜下观察软骨缺损区细胞增生较为旺盛且丰富，排列有方向性;C组显微镜下观察软骨缺损区软骨细胞增生旺盛与正常软骨组织交界存在一定裂隙;D组显微镜下观察软骨缺损区细胞增生旺盛且丰富，排列有方向性，少部分新生软骨近似透明软骨。术后12周:A组显微镜下观察可见软骨缺损区细胞增生旺盛排列紊乱生，增生组织基本为纤维结缔组织，未见明显的软骨组织增生;B、C两组显微镜下观察软骨损伤区细胞增生旺盛且丰富，排列有方向性，交界区模糊，整合良好，未见明显呈簇状分布的增生区域大量纤维结缔组织，有少量细胞向透明软骨细胞分化;D组显微镜下观察软骨损伤区细胞增生旺盛且丰富，排列有方向性，部分新生软骨近似透明软骨。
　　3、扫描电镜观察:正常软骨:可见关节软骨表面平坦，未见表面存在扭曲和皱缩纹理。造模后软骨:正常软骨区与缺损区可见明显阶梯状改变，正常软骨区规整平滑，未出现皱缩纹理，缺损区表面可见凹凸不平，犹如不平整的坑洼路面。术后12周D组软骨:电镜下观察可见交界区存在裂隙，缺损区修复组织靠近前叉韧带侧略显规整。
　　结论:
　　1、微骨折技术、富血小板血浆及二者联合应用均能有效的促进软骨全层缺损的修复作用。
　　2、单独应用微骨折技术或富血小板血浆12周组相比8周组并未有进一步改善甚至出现退变。
　　3、微骨折技术结合富血小板血浆12周组相比8周组未发生退变，并且达到比较良好的修复效果，是一种修复全层软骨损伤的有效方法。

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