A族链球菌上调A20表达以抑制巨噬细胞功能的机制研究

摘要

目的:A族链球菌(Group A streptococcus，GAS)即化脓性链球菌，一类重要的G+致病菌，它可以引起多种不同的化脓性疾病和非化脓性感染后遗症的产生。巨噬细胞是固有免疫中的主要效应细胞，通过其模式识别受体(PRR)与细菌表面的病原相关分子模式(PAMPs)结合产生效应。其中模式识别受体TLR活化后可以与接头蛋白MyD88作用，进一步激活TRAF6来调节NF-KB和MAPKs信号通路。NF-κB激活后转位入核，通过诱导转录因子、急性期蛋白和细胞因子等多种物质的表达来调控免疫反应以适应细胞生存。锌指蛋白A20是一种免疫负调节因子，在多种细胞受到LPS、TNF、CD40等刺激后可大量表达，以发挥双重泛素化酶作用。既能介导目的蛋白被蛋白酶体降解，又能抑制泛素化依赖信号的传导。其泛素化作用的底物包括:TRAF2、TRAF6、IKK、Caspase8、RIP1等。本室前期研究表明:GAS作为G+菌其活化巨噬细胞的炎症反应较G-菌微弱而迟滞，同时还伴随负调节蛋白A20的高表达。1为了探究这种高表达的负调节蛋白，是否与其导致的炎症反应低下相关，本研究中以E.coli作为G-菌的对照，GAS刺激鼠源巨噬细胞RAW267.4后分别检测细胞因子、NF-κB、TRAF6及A20在不同时间点核酸以及蛋白水平表达的差异。2为进一步证实A20高表达与炎症反应低下有关，A20SiRNA借助脂质体瞬时转染RAW264.7细胞，通过形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，特异性的降解A20的mRNA，从而导致其转录后基因沉默。3用GAS感染A20SiRNA预处理后RAW264.7细胞，检测细胞因子、NF-κB、TRAF6基因和蛋白水平的变化，对比A20SiRNA预处理组和不同对照组之间的差异，为GAS感染后通过巨噬细胞介导微弱而迟缓的炎症反应，来逃避宿主固有免疫系统的清除作用提供理论依据。4为了探究GAS感染巨噬细胞后A20的高表达是否与MyD88通路激活相关，用GAS或E.coli刺激MyD88-/-C57BL/6鼠和野生C57BL/6鼠BMDM细胞后，应用Western blot检测NF-κB、TRAF6、A20表达的变化。
　　方法:
　　1.RAW264.7细胞分别接受GAS或E.coli刺激，用Real-time PCR、CBA检测细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10的动态表达变化。
　　2.应用Western blot检测NF-κB、TRAF6、A20在GAS或E.coli分别刺激RAW264.7细胞和野生C57BL/6鼠BMDM细胞后不同时间点的变化情况。
　　3.应用RNA干扰技术，借助脂质体将A20SiRNA瞬时转染RAW264.7细胞而后GAS感染，行Western blot、BCA、Real-time PCR分别检测A20特异性的干扰后NF-κB、TRAF6以及细胞因子蛋白和基因水平的变化。
　　4.GAS或E.coli刺激MyD88-/-C57BL/6鼠和野生C57BL/6鼠BMDM细胞后，应用Western blot检测NF-κB、TRAF6、A20表达的变化。
　　结果:
　　1.Real-time PCR检测细胞因子mRNA的表达情况:GAS刺激组IL-1β、IL-6、TNF-α的表达在7小时以内低于E.coli刺激组，而IL-10的量却高于E.coli组。其中炎症因子:IL-1β、TNF-α分别都在3-5小时达高峰;而IL-6、IL-10的量分别在7小时左右达高峰。
　　2.CBA检测培养上清中细胞因子的表达:GAS刺激组在各个时间点细胞因子的表达量都比E.coli刺激组低，这与Real-time PCR的检测结果基本一致。
　　3.Western blot检测GAS或E.coli分别刺激RAW264.7细胞后NF-κB、TRAF6、A20的变化:GAS刺激后，A20从2小时开始表达明显升高，6、8小时达高峰;E.coli刺激后，A20从4小时开始表达，6、8小时达高峰。并且GAS刺激A20的表达明显高于E.coli刺激组，而A20所调控的下游分子TRAF6，以及核转录因子P65的表达则相应降低，在GAS刺激组低于E.coli刺激组。用C57BL/6鼠的BMDM细胞重复上述实验，结果一致且更为明显。
　　4.A20SiRNA瞬时转染RAW264.7细胞，随后，以等量GAS刺激该细胞以检测:
　　A20、TRAF6及P65的表达，结果显示，A20SiRNA瞬时转入RAW264.7细胞后，无论基因水平还是蛋白水平检测不到A20的表达。该细胞受GAS刺激后，P65、TRAF6表达显著升高，且炎症反应剧烈，细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-10表达明显升高。
　　5.Western blot检测MyD88-/-C57鼠和野生C57BL/6鼠BMDM细胞受GAS和E.coli刺激后A20的表达，结果显示:尽管MyD88-/-C57鼠BMDM细胞受到刺激，A20几乎不表达，远远低于野生C57BL/6鼠BMDM细胞受到刺激后的高表达。
　　结论:
　　1.GAS作为G+菌其活化巨噬细胞的炎症反应较G-菌微弱而迟滞，这与负调节蛋白A20的高表达有关。
　　2.负调节蛋白A20通过与底物TRAF6作用，抑制泛素化依赖信号的传导，从而下调NF-κB介导的炎症反应。
　　3.GAS刺激鼠源巨噬细胞后，A20的高表达是依赖于TLRs的下游MyD88通路的活化。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 方法

结果

附图

讨论

结论

参考文献

综述 A族链球菌致病机制的研究

致谢

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