丁苯酞对STZ糖尿病大鼠认知功能障碍及海马NMDA受体亚基NR2B的影响

摘要

目的:糖尿病可导致认知功能障碍，主要表现为学习、记忆能力下降，严重者可导致痴呆。证据表明，离子型谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体的NR2B亚基通过影响海马的突触可塑性参与学习、记忆的形成，与糖尿病认知功能障碍有着密切的联系。丁苯酞是一种具有改善微循环，保护线粒体等作用的神经保护药物，已广泛应用于缺血性脑血管病，同时对糖尿病认知功能障碍也具有改善作用，但其具体机制目前尚不清楚。本实验通过预防性应用丁苯酞，观察不同剂量丁苯酞对糖尿病大鼠认知功能和海马NMDA受体亚基NR2B表达的影响，为糖尿病认知功能障碍的防治提供新思路。
　　方法:
　　1、STZ糖尿病大鼠模型制备
　　清洁级健康雄性SpragueDawley(SD)大鼠，通过腹腔注射60mg/kg的链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)建立1型糖尿病大鼠模型，对照组注射等体积的生理盐水。72小时后测量尾静脉的血糖，血糖值≥16.7mmol/L者，表示STZ糖尿病大鼠模型形成。
　　2、分组
　　适应性喂养一周后，55只SD大鼠随机分为正常对照组(NC组，n=10)和糖尿病组（DM组，n=45）。糖尿病组又随机分为3组:糖尿病对照组(DC组，n=15)，丁苯酞低剂量组(DL组，60mg.kg-1.d-1，n=15)和丁苯酞高剂量组（DH组，120mg.kg-1.d-1，n=15）。成模后第一天开始干预，丁苯酞原液用玉米油溶解后灌胃，NC组和DC组以等体积的玉米油灌胃，每日1次。各组均干预12周。
　　3、一般观察
　　每周测量大鼠血糖及体重。观察大鼠精神状态、进食水量及尿量等一般情况。
　　4、行为学测试
　　应用丁苯酞干预12周末行Morris水迷宫测试，包括定位航行和空间探索两部分。记录各组大鼠逃避潜伏期及穿越平台次数。分析各组大鼠的学习、记忆能力。
　　5、形态学及mRNA、蛋白观察指标
　　水迷宫测试后处死大鼠，取大脑海马组织。应用HE染色法观察海马组织形态，实时定量聚合酶链反应(Real-Timepolymerasechainreaction，Real-TimePCR)、蛋白质免疫印迹(Western-Blot)和免疫组织化学染色法检测大鼠海马组织中NMDA受体亚基NR2BmRNA和蛋白水平的表达。
　　6、统计学方法
　　采用SPSS13.0软件进行统计分析，应用完全随机设计的单因素方差分析;水迷宫实验结果用重复测量方差分析统计，使用重复测量数据多重比较配对的t检验法(Bonferroni法)，可进行每个分组每个时间点上作用的两两比较;使用多元方差分析的方法，可进行每个时间点上每个分组之间作用的两两比较。因数据符合正态分布(P＞0.1)，故应用均数±标准差表示结果，应用p＜0.05表示差异有统计学意义。
　　结果:
　　1、一般情况观察
　　正常对照组大鼠精神状态良好，反应灵敏，毛色纯白有光泽，进食水及尿量正常;糖尿病组大鼠精神状态差，精神萎靡，易激惹，毛色稀疏枯黄无光泽，有多食、多饮、多尿症状。
　　比较成模前及成模后12周末的血糖和体重情况:
　　成模前:NC组和DM组大鼠血糖(mmol/L)均正常，差异无统计学意义（7.19±0.54VS7.18±0.46，P＞0.05）;体重(g)变化也无统计学意义（130.46±4.98VS132.08±4.36,P＞0.05)
　　成模后12周末:与同期NC组相比，DM各组大鼠血糖均保持明显升高（30.13±2.08,29.35±2.57,28.18±2.19VS7.44±0.47,P＜0.01），体重明显降低（237.77±14.87，242.73±14.75，245.00±13.07VS340.14±6.65，P＜0.01），均有统计学意义;但糖尿病各亚组之间血糖及体重比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　2、行为学观察(Morris水迷宫测试结果)
　　2.1基础游泳速度
　　水迷宫测试前，为排除大鼠个体游泳速度差异，各组中随机选取5只大鼠，让其自由游泳60S，测量其基础游泳速度，结果显示:各组大鼠之间基础游泳速度差异无统计学意义(30.97±1.96，30.73±2.04，29.72±2.95和30.00±2.36，P＞0.05)。
　　2.2定位航行
　　第1天各组大鼠逃避潜伏期无明显区别（P＞0.05）;第2-5天DC组逃避潜伏期较NC组明显延长(P＜0.05)，DL和DH组较DC组逃避潜伏期明显缩短，但仍高于NC组(P＜0.05)，而DH组从第3天到第5天，逃避潜伏期较DL组明显缩短，差异有统计学意义（p＜0.05），组别和天数之间不存在交互作用(P＞0.05)。
　　各组间第5天与第1天逃避潜伏期的变化:DC组逃避潜伏期无明显变化(P＞0.05)NC、DL和DH组，逃避潜伏期明显缩短(P＜0.05)。
　　各组间逃避潜伏期的顺序为:NC组＜DH组＜DL组＜DC组。
　　2.3空间探索
　　与NC组相比，DC组穿越平台次数明显减少（3.00±0.64VS15.68±1.57，P＜0.05）;
　　与DC组相比，DL和DH组（9.01±1.1和11.68±1.57）穿越平台次数明显增加，但仍少于NC组(P＜0.05);
　　与DL组相比，DH组穿越平台次数明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）;
　　各组间穿越平台次数的顺序为:NC组＞DH组＞DL组＞DC组。
　　3、HE染色
　　NC组大鼠海马椎体神经元细胞排列整齐，层次清楚，形态完整，核大而圆。DC组神经元细胞排列紊乱，层次不清，细胞可见空泡变性，出现细胞膜断裂，细胞质减少，细胞核固缩。丁苯酞治疗组上述改变较DC组明显减轻，且DH组优于DL组。
　　4、海马组织中NR2BmRNA及蛋白的表达
　　4.1海马组织NR2BmRNA的表达
　　与NC组相比，DC组，DL组和DH组海马NR2BmRNA的表达均显著降低（0.14±0.01，0.23±0.01，0.29±0.01VS0.35±0.02，P＜0.05）;
　　与DC组相比，DL和DH组海马NR2BmRNA的表达均显著增加(P＜0.05);
　　与DL组相比，DH组海马NR2BmRNA的表达显著增加(P＜0.05)
　　4.2海马组织NR2B蛋白表达
　　与NC组相比，DC组，DL组和DH组海马NR2B蛋白的表达均显著降低(0.37±0.03，0.49±0.04，0.60±0.04VS0.68±0.05，P＜0.05);
　　与DC组相比，DL和DH组海马NR2B蛋白的表达均显著增加(P＜0.05);P
　　与DL组相比，DH组海马NR2B蛋白的表达亦显著增加(P＜0.05)5免疫组织化学染色
　　与NC组相比，DC组大鼠海马组织中的NR2B阳性细胞表达显著减少（平均光密度值:0.16±0.01VS0.47±0.10，P＜0.05）;
　　与DC组相比，DL和DH组海马组织中的NR2B阳性细胞表达均显著增加（平均光密度值:0.27±0.11，0.37±0.14VS0.47±0.10，P＜0.05），但仍低于NC组（P＜0.05）。
　　与DL组相比，DH组海马组织中的NR2B阳性细胞表达显著增加，有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　1、STZ糖尿病大鼠12周末学习记忆能力明显下降，出现认知功能障碍。
　　2、糖尿病大鼠出现认知功能障碍时，海马组织中NR2B的表达下降。
　　3、预防性应用丁苯酞，可改善糖尿病认知功能障碍，提高海马组织中NR2B的表达，并且丁苯酞高剂量组(120mg/kg)的疗效优于丁苯酞低剂量组(60mg/kg)。推测丁苯酞可能通过上调海马NR2B的表达改善糖尿病认知功能。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

3 统计学方法

结果

1 大鼠一般状况比较

2 行为学观察(Morris水迷宫测试结果)

3 HE染色

4 海马组织中NR2B mRNA及蛋白的表达

5 免疫组织化学染色

附图

附表

讨论

1 糖尿病认知功能障碍的研究现状

2 糖尿病认知功能障碍的行为学测试方法

3 糖尿病认知功能障碍的机制

4 糖尿病认知功能障碍的预防和治疗

结论

参考文献

综述 N-甲基-D-天冬氨酸受体与糖尿病认知障碍

致谢

个人简历