硫酸镁对UUO大鼠模型Nox4、TGF-β1、p-ERK1/2及Ⅲ型胶原表达的影响

摘要

目的：肾间质纤维化（Renal interstitial fibrosis RIF）几乎是所有慢性肾脏疾病的最终结果，与慢性肾衰竭进展密切相关，是导致终末期肾病的主要病因。肾间质纤维化往往伴随着肾间质成纤维细胞及肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化（EMT）的细胞内信号转导。研究发现，多种导致肾间质纤维化的致病因素，如代谢因素、梗阻因素、炎症反应等，均可引起肾脏局部的氧化应激增强，活性氧（ROS）生成增加，氧化与抗氧化系统失衡，从而导致肾组织进一步损伤，最终导致肾小管萎缩及间质纤维化。氧化应激反应是肾间质纤维化形成的关键因素之一，可刺激各种细胞因子、激活多条信号通路等，对肾纤维化过程中EMT的发生发展起着重要作用。近年来NADPH氧化酶家族（NOXS）在糖尿病、高血压肾损害、5/6肾切除等多种肾脏病理模型中被确认为是肾脏局部氧化应激反应的重要促氧化系统。许多研究发现：转化生长因子（TGF-β）及其下游因子如胞外信号调节激酶（ERK）是诱发ETM的关键因子，但这一过程是否通过NADPH氧化酶调节研究尚少。硫酸镁在缺血性脑卒中等疾病中有抗氧化作用，但在保护肾间质纤维化方面未见报道。本实验的目的是通过硫酸镁干预，观察其对SD大鼠单侧输尿管梗阻模型中TGF-β、Nox4、磷酸化(p)-ERK1/2及Ⅲ型胶原蛋白表达的影响，研究 NADPH氧化酶是否参与TGF-β/ROS/ERK这一过程的调节，探讨硫酸镁保护肾脏的可能机制，为延缓肾间质纤维化的进展提供新的治疗靶点。
　　方法：采用单侧输尿管梗阻（UUO）模型，将72只清洁级SD大鼠(雄性，180～220g)，随机分为A、B、C、D4组：假手术组（行手术分离左侧输尿管但不结扎）、模型组(结扎左侧输尿管近肾盂段)、高剂量硫酸镁组及低剂量硫酸镁组。假手术及模型组每天均给予等量生理盐水腹腔注射。高剂量硫酸镁组、低剂量硫酸镁组分别给予硫酸镁300mg/kg/d、100mg/kg/d腹腔注射。实验期间动物自由摄食水，每天注意观察SD大鼠的一般状况如精神、饮食、活动。分别于术后第3、7、14天每组各取6只SD大鼠，取左侧梗阻肾组织后予以处死。用0.9％盐水充分清洗肾组织后，并将其分为大小2个部分，取其中一小部分肾组织放入10%福尔马林溶液固定，用以做病理切片及免疫组织化学染色；将另外一部分肾组织放入液氮使其迅速冷冻，以防止蛋白降解，并保存在-80℃冰箱中，用以做Western blot实验。应用SPSS21.0统计软件对所有实验数据进行统计学分析，P＜0.05表示结果有统计学差异。
　　结果：
　　1.肾脏组织病理形态改变
　　1.1 肉眼观察：新鲜的A组肾脏组织颜色、大小均正常；B、C、D三组梗阻侧肾脏组织随时间延长均有不同程度增大，可见肾内积水，肾皮质变薄，其中尤以B组肾脏增大、肾内积水最为明显，C、D组肾脏组织颜色、大小均较B组轻。
　　1.2 光镜观察：
　　1.2.1 HE染色
　　观察A组大鼠肾组织结构正常，肾小球及肾小管无异常改变。B组大鼠可见肾小管上皮细胞脱落、坏死，炎细胞浸润肾间质，肾间质增宽，间质纤维化，肾小管扩张、萎缩、塌陷，基底膜弥漫性增厚，并且随着病变时间的延长，肾间质、小管的结构基本消失；而肾小球病变程度不一。C、D组与B组比较病变程度均有所减轻。C组较D组减轻明显。
　　1.2.2 Masson染色
　　A组显示肾组织结构正常，肾小管及肾间质未见明显异常。B组Masson染色可见肾小管广泛扩张，肾间质较前增宽，间质组织、细胞较前增多，肾间质可见胶原纤维沉积，随着病变进展胶原纤维逐渐向肾组织周围延伸，并且相互交织成“网状”。C、D组与B组比较均有不同程度的减轻。C组较D组减轻明显。
　　2.免疫组化结果
　　2.1 TGF-β1：A组，SD大鼠肾小管上皮细胞中TGF-β1阳性表达很弱；B组，肾组织小管上皮细胞中TGF-β1阳性表达明显增加，随着病变的进展持续增加，且与同时相A组相比均有统计学差异(P<0.05)；C、D组，TGF-β1的阳性表达与同一时期B组相比较均有明显下降(P<0.05)，但仍高于同一时相A组中(P<0.05)的阳性表达水平，同期C、D两组比较，C组阳性表达水平较D组显著下降(P<0.05)。
　　2.2 Nox4:A组，SD大鼠肾组织中Nox4阳性表达很弱；B组，阳性表达明显增加，且随着病变的进展，其表达水平持续增加，且与同一时期 A组相比较均有统计学差异(P<0.05)；C、D组与同期B组相比，Nox4的阳性表达均有显著下降(P<0.05)，但与同期A组相比Nox4的表达水平仍明显增高(P<0.05)，而同期C、D两组比较，C组表达水平较D组明显下降(P<0.05)。
　　2.3 p-ERK1/2：A组，在肾小管上皮细胞核中有一定水平的表达；B组，肾小管上皮细胞核中出现广泛水平的表达，随着梗阻时间的延长，其表达水平呈进行性升高，且与A组同时相相比较均有统计学差异(P<0.05)；C、D组，p-ERK1/2的表达水平与同期 B组表达水平相比较均有显著下降(P<0.05)，但仍高于同期A组中(P<0.05)的表达水平，同期C、D两组比较，C组表达水平较D组显著下降(P<0.05)。
　　2.4 Ⅲ型胶原蛋白：正常情况下在肾小管上皮细胞、间质细胞及肾小球系膜细胞胞浆中有少量表达。A组，肾小管上皮细胞中可见少量表达；B组，肾小管上皮细胞中可见表达，随着梗阻时间的延长，其表达水平呈进行性升高，且与A组同时相相比较均有统计学差异(P<0.05)；C、D组，Ⅲ型胶原蛋白的表达水平与同期B组表达水平相比较均有显著下降(P<0.05)，但仍高于同期A组(P<0.05)的表达水平，同期C、D两组比较，C组表达水平较D组显著下降(P<0.05)。
　　3.Western Blot结果
　　Western实验Nox4蛋白的表达：与同期A组相比，B组Nox4蛋白表达均增加（P<0.05），各组间均有统计学差异（P<0.05）。C、D组，Nox4蛋白的表达水平与同期B组表达水平相比较均有显著下降(P<0.05)，但仍高于同期A组中(P<0.05)的表达水平，同期C、D两组比较，C组表达水平较D组显著下降(P<0.05)。
　　结论：TGF-β1、Nox4、p-ERK1/2和Col-Ⅲ在梗阻侧肾脏表达增加，且具有时间依赖性。硫酸镁通过下调Nox4的表达，减轻TGF-β1、p-ERK1/2和Ⅲ型胶原在肾脏的表达，从而可能起到延缓及减轻肾间质纤维化的作用。硫酸镁减轻肾间质纤维化的作用机制之一可能是通过下调Nox4，抑制ROS作用保护肾脏功能。

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前言

材料与方法

1 材料

1.1 实验动物

1.2 试剂

1.3 药物

1.4 主要仪器

1.5常用试剂的配制

2实验方法

2.1 单侧输尿管梗阻大鼠模型的制备、分组及干预治疗

2.2 动物饲养

2.3 标本采集和处理

2.4 肾脏组织病理学染色

2.5 免疫组织化学

2.6 Western Blot

结果

1 大鼠一般情况观察

2 大鼠肾脏组织病理改变

2.1 大体标本

2.2 光镜下采图分析

3 免疫组织化学染色

3.1 TGF-β1染色

3.2 Nox4染色

3.3 p-ERK1/2染色

3.4 Ⅲ型胶原蛋白染色

4 Western Blot半定量结果分析

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述: NADPH氧化酶在肾脏疾病中的研究进展

致谢

个人简历