环氧化酶2在食管癌中的表达及环氧化酶2抑制剂对食管癌小鼠移植瘤生长的影响

摘要

目的:食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，具有很明显的地域性分布性。由于食管癌早期症状不典型，人们缺乏保健意识等原因，确诊时多已发展到晚期，所以预后差。近年来研究表明，环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)在恶性肿瘤的形成过程中有重要作用，它可促进肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤的侵袭、转移等。动物实验证明，对肿瘤的治疗选择性COX-2抑制剂有显著作用。因此针对肿瘤的COX-2靶点，可以选用选择性COX-2抑制剂来治疗。
　　尼美舒利是新型选择性COX-2抑制剂，动物实验证实，尼美舒利不仅可以抑制肿瘤生长与转移、预防肿瘤形成，还可与化疗、放疗联合应用，具有增强化疗、放疗效果的作用。奥沙利铂是第三代化疗药，通过产生水化衍生物，使DNA链内和链间形成交联，从而抑制DNA的复制及合成。
　　本实验从食管癌手术治疗的标本、人食管癌小鼠移植瘤两方面，采用多种实验方法研究COX-2在食管癌发生过程中的作用，观察COX-2抑制剂尼美舒利、化疗药物奥沙利铂的联合应用对人食管癌小鼠移植瘤生长的抑制作用，进一步探讨这两种药物联合应用可能产生的协同作用。
　　方法:
　　1、食管癌中COX-2的表达及意义
　　手术切除食管癌新鲜标本63例，术后立即取材，分别于10％福尔马林固定，常规包埋、切片，HE染色，由两名有经验病理科医师进行组织病理学诊断。采用免疫组织化学方法检测COX-2蛋白的表达。新鲜标本经70％乙醇处理后，采用流式细胞术(Flow cytometry，FCM)定量检测标本中的COX-2蛋白表达。
　　2、尼美舒利、奥沙利铂联合应用对人食管癌小鼠移植瘤生长的影响
　　选取C57BL/6小鼠6-7周龄，雄性，体重25-30g，在IVC环境中以灭菌处理过的饲料和水饲养，环境温度、湿度控制在适宜范围。将人食管癌Eca-109细胞使用含10％胎牛血清、青霉素、链霉素各100U.mL-1的DMEM/F12培养基，在37℃的恒温下，用含5％的二氧化碳培养箱中常规培养。观察细胞至70％-80％融合时，用2.5g.L-1胰蛋白酶消化传代。取生长状态良好的对数生长期的人食管癌Eca-109细胞，PBS洗涤，用2.5g.L-1胰蛋白酶消化下来，制成细胞悬液。用不含胎牛血清的DMEM/F12培养基稀释，用细胞计数板进行计数，调整细胞悬液浓度为5106.mL-1。小鼠皮肤备皮、消毒后用1ml注射器在右侧后臀部注射上述单细胞悬液1ml，建立人食管癌小鼠移植瘤模型。26只全部成瘤，定期测量肿瘤长径、短径，待肿瘤平均直径为4mm后，剔除肿瘤偏小的2只小鼠。将24只小鼠随机分为4组，每组6只，组别为对照组，尼美舒利组，奥沙利铂组，尼美舒利/奥沙利铂组。尼美舒利组小鼠给予灌胃口服尼美舒利20mg/Kg/次，每天给药一次，同时腹腔注射等量灭菌生理盐水;奥沙利铂组小鼠给予腹腔注射奥沙利铂甘露醇注射液10mg/Kg/次，每4天给药一次，同时灌胃口服等量灭菌生理盐水;尼美舒利/奥沙利铂组小鼠，同时灌胃口服尼美舒利，腹腔注射奥沙利铂甘露醇注射液，剂量与单用组相同;对照组小鼠，灌胃口服灭菌生理盐水，腹腔注射等量灭菌生理盐水。定期观察小鼠生长情况，每5天测量1次肿瘤的体积。30天后，处死小鼠切赊肿瘤组织，测量4组小鼠移植瘤长径、短径及瘤重，估测瘤体体积和肿瘤生长抑制率并取材。FCM法定量检测移植瘤中COX-2蛋白的表达，FCM法检测移植瘤中细胞的凋亡率。
　　结果:
　　1、COX-2在食管癌变过程中的表达
　　免疫组织化学结果显示，食管癌细胞COX-2基因表达产物主要定位于细胞浆，胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性。在癌旁组织中表达率为20％，食管癌组织中表达率为90％。FCM定量检测COX-2含量结果显示:正常食管鳞状上皮中COX-2的FI值为1.00±0.12，随着食管鳞状上皮异型性增高，COX-2的表达升高，在高分化癌中表达最高，FI值为2.89±0.22。在食管鳞状细胞癌组织中随着癌组织的分化程度降低而COX-2的表达减少。
　　2、尼美舒利联合奥沙利铂对人食管癌小鼠移植瘤生长的影响及机制
　　接种小鼠26只，全部成瘤，成瘤率100％，成瘤时间为细胞接种后5-8天。肿瘤细胞种植后13天，肿瘤平均直径达4mm。
　　治疗结束后，各组体积分别为:对照组:移植瘤体积2047.42±976.55mm3，瘤重1.41±0.49g;尼美舒利组:移植瘤体积1267.14±476.38mm3，瘤重0.97±0.51g;奥沙利铂组:移植瘤体积1054.28±102.82mm3，瘤重0.89±0.20g;尼美舒利/奥沙利铂联合用药组:移植瘤体积532.66±220.11 mm3，瘤重0.45±0.31g。尼美舒利组、奥沙利铂组和尼美舒利/奥沙利铂联合用药组的抑瘤率分别为46.22％、51.93％和72.88％。方差分析组间差异显示:尼美舒利组、奥沙利铂组和尼美舒利/奥沙利铂联合用药组移植瘤生长明显较对照组缓慢(P＜0.05)。尼美舒利/奥沙利铂联合用药组抑瘤率明显较尼美舒利组、奥沙利铂组高(P＜0.05)。尼美舒利组和奥沙利铂组对移植瘤的生长的抑制作用未见明显差异(P＞0.05)。
　　FCM定量检测移植瘤的细胞凋亡，对照组食管癌细胞凋亡率为（12.12±0.47）％，尼美舒利组凋亡率为(22.16±5.24)％，奥沙利铂组凋亡率为（27.33±7.25）％，尼美舒利/奥沙利铂联合用药组凋亡率为（47.26±6.73）％。方差分析组间差异显示:尼美舒利组、奥沙利铂组和尼美舒利/奥沙利铂联合用药组凋亡率较对照组升高，有显著性差异(P＜0.05)。尼美舒利/奥沙利铂联合用药组凋亡率明显较尼美舒利组、奥沙利铂组高，有显著性差异(P＜0.05)。尼美舒利组和奥沙利铂组对凋亡率的影响未见明显差异(P＞0.05)。
　　FCM定量检测移植瘤中COX-2蛋白表达，尼美舒利组FI=0.598±0.090，奥沙利铂组FI=1.390±0.192，尼美舒利/奥沙利铂组FI=0.791±0.121。方差分析结果显示，尼美舒利及尼美舒利/奥沙利铂联合用药组COX-2蛋白表达水平低于对照组，并有显著性差异(P＜O.05)。奥沙利铂组COX-2蛋白表达水平高于对照组，并有显著性差异(P＜0.05)。
　　结论:
　　1、在癌旁组织和食管癌组织中，COX-2的表达增高，表明在食管上皮癌变过程中COX-2可能起重要作用。食管鳞状细胞癌组织中，随食管癌组织分化程度降低，COX-2的表达降低。
　　2、尼美舒利及奥沙利铂均能抑制肿瘤的生长，尼美舒利/奥沙利铂联合用药组抑瘤率明显高于单用组。尼美舒利能提高了奥沙利铂的对肿瘤的抑制效果，这种效果是通过诱导肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤的。
　　综上所述，本实验从食管癌手术标本，小鼠移植瘤两个方面进行研究，结果表明:COX-2在食管癌变过程中起重要作用，选择性COX-2抑制剂尼美舒利或联合奥沙利铂，均可通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤。尼美舒利与奥沙利铂联合应用，可提高奥沙利铂的肿瘤抑制作用。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 COX-2在食管癌的表达及意义

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 尼美舒利联合奥沙利铂对食管癌小鼠移植瘤生长的影响及其相关机制的研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 COX-2抑制剂抗肿瘤机制与在肿瘤治疗中的作用

致谢

个人简历