硫辛酸抑制2型糖尿病大鼠肾脏氧化应激及mTOR信号转导通路激活

摘要

目的：
　　糖尿病肾脏病（diabetic kidney disease，DKD）是2型糖尿病（type2 diabetes mellitus，T2DM）常见微血管并发症之一，并已成为导致患者终末期肾脏疾病甚至死亡的主要原因。DKD的发病机制尚未系统阐明，目前认为糖脂代谢紊乱、血流动力学改变、氧化应激、炎症反应、肾脏自噬抑制等与DKD发生发展有着密切联系,其中氧化应激是DKD重要发病机制，还可以介导炎症反应进一步加速肾脏损伤。8-羟基脱氧鸟嘌呤（8-hydroxy-2-deoxygnanosine，8-OHdG）是一种目前反映DNA氧化损伤及体内氧化应激的敏感指标。近年来，随着对雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路研究的逐渐深入，发现mTOR通路的激活促进肾脏细胞肥大、蛋白质合成增加，参与氧化应激、炎症反应并抑制肾脏细胞自噬，在局灶节段性肾小球硬化、膜性肾病等慢性肾脏疾病的发病中起重要作用。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine5’-monophosphate-activate protein kinase，AMPK）是调控mTOR的上游信号之一，其主要通过抑制mTOR信号通路发挥作用。硫辛酸作为抗氧化剂，可以抑制氧自由基的生成，临床上用于糖尿病周围神经病变治疗收到了良好疗效，但对DKD有无作用尚不明确。本实验通过复制T2DM大鼠模型，测定各组大鼠肾脏中AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR的表达情况及体内8-OHdG水平，以探讨mTOR信号通路、氧化应激与T2DM肾脏病的关系及硫辛酸对肾脏mTOR信号通路及氧化应激的影响。
　　方法：
　　22只雄性清洁级Sprague-Dawley（SD）大鼠，鼠龄6周，体重为180g±20g，清洁级环境饲养。应用excel随机数字表法将大鼠随机分为正常对照组（NC组，n=6）、糖尿病组（DM组，n=8）、硫辛酸干预组（LA组，n=8）。正常对照组大鼠继续予以普通饲料喂养，其余两组大鼠予以高糖高脂饲料（蔗糖20％、猪油10%、胆固醇2.5%，胆酸盐1%，基础饲料66.5%）喂养。4周后，糖尿病组及硫辛酸干预组大鼠给予30 mg/kg链脲佐菌素腹腔注射，正常组大鼠腹腔注射等体积柠檬酸缓冲液，注射2周后测定大鼠空腹血糖（fasting blood glucose， FBG）， FBG＞7.8mmol/L视为T2DM造模成功。随后硫辛酸干预组予以100 mg/kg硫辛酸腹腔注射，正常对照组和糖尿病组均以等体积生理盐水腹腔注射，每日给药1次，连续给药8周。实验结束前一日收集各组大鼠24小时尿液，用于测定24小时尿蛋白；当日留取血清用于测定肾功能和8-OHdG等指标；取左肾称重后，4%多聚甲醛固定，行HE染色和PAS染色观察肾脏组织形态学变化，行Masson染色观察肾脏组织纤维化情况。免疫组织化学染色法检测大鼠肾脏AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR的表达。
　　结果：
　　1各组大鼠体重及肾脏肥大指数的比较
　　正常组大鼠体重为（455.17±22.46）g，肾脏肥大指数为（3.65±0.24） mg/g；糖尿病组大鼠体重为（250.67±26.56）g，肾脏肥大指数为（7.12±0.28） mg/g；硫辛酸组大鼠体重为（259.20±15.48）g，肾脏肥大指数为（6.10±0.45） mg/g。
　　与正常组相比，糖尿病组和硫辛酸组大鼠体重减轻，肾脏肥大指数升高(P＜0.01)；与糖尿组相比，硫辛酸组大鼠肾脏肥大指数降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），两组大鼠体重无统计学差异（P＞0.05）。
　　2各组大鼠生化指标的比较
　　正常组大鼠血糖为（5.17±0.71）mmol/L，尿蛋白为（15.27±1.45） mg/24h，血肌酐为（37.23±4.97）μmol/L，血尿素氮为（6.38±1.18）mmol/L；糖尿病组大鼠血糖为（21.38±1.66）mmol/L，尿蛋白为（314.00±16.14） mg/24h，血肌酐为（36.70±4.80）μmol/L，血尿素氮为（7.52±1.21）mmol/L；硫辛酸组大鼠血糖为（20.60±0.60）mmol/L，尿蛋白为（249.88±28.61） mg/24h，血肌酐（37.80±4.03）μmol/L，血尿素氮（7.76±1.24）mmol/L。
　　与正常组相比，糖尿病组和硫辛酸组大鼠的血糖和24小时尿蛋白均显著升高(P＜0.01)，血肌酐和血尿素氮无明显差异（P＞0.05）；与糖尿病组相比，硫辛酸组大鼠24小时尿蛋白降低(P＜0.01），血糖、血肌酐和血尿素氮无明显差异（P＞0.05）。
　　3各组大鼠8-OHdG的比较
　　正常组大鼠8-OHdG为（1.63±0.62）ng/ml，糖尿病组大鼠8-OHdG为（5.09±0.89）ng/ml，硫辛酸组8-OHdG为（2.84±0.64）ng/ml。
　　与正常组相比，糖尿病组和硫辛酸组大鼠的8-OHdG明显升高(P＜0.05)；与糖尿病组相比，硫辛酸组8-OHdG水平明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　4各组大鼠肾脏形态学改变
　　肾脏HE染色：正常组大鼠肾脏各组织形态正常、结构清晰，无炎性细胞浸润。糖尿病组大鼠肾小球毛细血管袢开放不良，系膜区扩张，部分肾小管细胞出现空泡变性，间质有较多炎性细胞浸润。与糖尿病组相比，硫辛酸组上述病理变化减轻。
　　肾脏PAS染色：正常组系膜基质指数为（0.1754±0.0149），糖尿病组系膜基质指数为（0.4052±0.0523），硫辛酸组系膜基质指数为（0.2259±0.0103）；与正常组相比，糖尿病组及硫辛酸组大鼠基底膜增厚，系膜基质明显增多(P＜0.05)；与糖尿病组相比，硫辛酸组大鼠系膜基质明显减少，差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　肾脏Masson染色：与正常组相比，糖尿病组及硫辛酸组大鼠肾小球蓝色胶原纤维明显增多；与糖尿病组相比，硫辛酸大鼠胶原纤维沉积减少。
　　5免疫组化检测结果
　　各组大鼠肾脏mTOR和AMPK均有表达，差异无统计学意义（P＞0.05）。正常组大鼠肾脏 p-mTOR蛋白少量表达， IOD/Area为（0.0230±0.0034）；糖尿病组和硫辛酸组大鼠肾脏p-mTOR蛋白表达明显增加（P＜0.05），IOD/Area分别为（0.0547±0.0089）和（0.0316±0.0039）；与糖尿病组相比，硫辛酸组大鼠肾脏p-mTOR表达减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。正常组大鼠肾脏p-AMPK蛋白表达呈棕黄色颗粒沉着， IOD/Area为（0.0317±0.0040）；与正常组相比，糖尿病组大鼠肾脏p-AMPK蛋白表达减少，IOD/Area为（0.0183±0.0024）（P＜0.01）；与糖尿病组相比，硫辛酸组大鼠脏p-AMPK表达增加，IOD/Area为（0.0273±0.0026），差异均有统计学意义（P＜0.01）。
　　结论：
　　1糖尿病组大鼠肾脏组织出现典型病理改变，肾脏肥大指数和24小时尿蛋白升高，并且8-OHdG水平和mTOR蛋白磷酸化明显升高，说明氧化应激增加及mTOR信号通路激活与糖尿病肾脏病变有关。
　　2硫辛酸组大鼠肾脏肥大指数和24小时尿蛋白降低，8-OHdG水平明显下降，且肾脏病理改变减轻，说明硫辛酸可以降低糖尿病大鼠体内氧化应激，延缓糖尿病大鼠肾脏病变进展。
　　3硫辛酸组大鼠mTOR蛋白磷酸化水平明显降低，AMPK蛋白活化增加，说明硫辛酸可激活AMPK蛋白，抑制mTOR信号通路，在糖尿病肾脏病变中起到的保护作用。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

3 统计学方法

结果

2各组大鼠体重和肾脏肥大指数的比较

3各组大鼠的血糖比较

4各组大鼠24小时尿蛋白及肾功能的比较

5各组大鼠8-OHdG的比较

6各组大鼠肾脏形态学改变

7免疫组化检测结果

附图

附表

讨论

1 糖尿病肾脏病

2 mTOR信号通路在DKD发生中的作用

3硫辛酸对DKD的保护作用

结论

参考文献

综述1:mTOR信号转导通路与糖尿病肾脏病

综述2:妊娠期糖尿病诊疗指南的变迁

致谢

个人简历