奥替普拉对大鼠放射性舌炎的预防作用及其机制

摘要

研究背景：放射性口腔黏膜炎(ROM)是指各种放射引起的急慢性口腔黏膜损伤。几乎在每例头颈部放疗过程中，位于投照范围内的口腔黏膜均出现不同程度的充血、红斑、溃疡、假膜和疼痛，破溃的黏膜成为继发系统性感染的通道，造成营养吸收不良、体重下降、心理障碍等全身症状，显著影响患者的生活质量，严重时甚至危及患者生命。上述状况迫使患者改变预定的治疗计划、放弃抗肿瘤治疗、延长住院时间、增加医疗资源耗费、加重社会医疗经济负担等。因此，ROM是头颈部恶性肿瘤放射治疗的主要剂量限制因素，并成为临床亟待解决的重大课题。经过半个世纪的研究，在ROM的临床特征、各种评估量表等方面已取得阶段性的进展。通过临床观察和动物实验，也已较清楚ROM的基本发病过程。但是，循证医学研究显示，除了缓解疼痛、防止脱水、加强营养、感染控制等对症处理，目前缺乏临床可应用的针对ROM的防治措施。究其原因，是因为其发病机制复杂，发病机理迄今仍未阐明，有待于深入研究，方可建立基于发病机制(mechanisms-based)的防治策略。本研究拟建立放射性舌炎SD大鼠动物模型，观察CECs、局部病损中的细胞因子在其发生、演进过程中是否存在改变，探讨奥替普拉对放射性舌炎的预防作用及其可能机制。本文分为两个部分：
　　 第一章：放射性舌炎SD大鼠动物模型的建立及其炎症反应特点。
　　 目的：分析和借鉴现有的RTOM动物模型，建立放射性舌炎(radiotherapy-inducedglossitis，RTG)动物模型，通过动态检测RTG大鼠外周血中循环内皮细胞(CECs)形态和数量及舌炎病损局部血管内皮细胞的病理损伤情况，探讨CECs和RTG形成及病情严重程度的关系。观察舌炎病损局部相关细胞因子的动态变化，以期探索炎症相关因子在RTG形成过程中的作用规律及其意义，为防治RTG提供研究平台。
　　 方法：自行设计和制作锥形铅质罩装置及附件，在SD大鼠舌背舌尖部位形成1×1cm2的照射区域，遮挡实验鼠其余部位，实施单次、单剂量(30Gy)X射线，照射条件为电压210kV，电流12mA，源皮距为40cm，照射野为10cm×15cm，4mm铅滤过系统，吸收剂量率为100.75cGy/min，每次照射6只的方法，制作RTG大鼠模型。观测RTG大鼠的体重、口腔黏膜炎指数(OMI)、组织病理学变化。应用免疫组织化学方法(Ⅷ因子相关抗原，Ⅷ-RAg)鉴定外周血是否存在CECs；血细胞计数板测定大鼠外周血中CECs计数；TUNEL检测RTG大鼠舌体病损组织内血管内皮细胞凋亡；统计学分析CECs与RTG口腔黏膜炎指数(OMI)、血管内皮细胞凋亡百分数间的时相变化关系。用抗体芯片技术检测19种细胞因子，初步筛选RTG相关细胞因子的动态变化，Real time-PCR反应检测炎性相关因子的mRNA水平，ELISA定量检测RTG病变组织的IL-1、IFN-γ、TIMP-1水平。
　　 结果：实验鼠接受单次30Gy照射后3-4 d未能观察到显著变化，镜下见上皮层尚完整，部分出现鳞状上皮增生，棘细胞层增厚，上皮开始炎症细胞浸润，毛细血管扩张充血；5-6 d，观察到受照射的舌黏膜(舌背、舌腹)出现红色斑点和成片变红(黏膜下出现充血)，镜下可见上皮下固有层血管进一步扩张、充血、管壁变薄，组织上皮下出现炎症细胞浸润，出现上皮变薄，固有层细胞核浓缩现象，鳞状上皮坏死脱落，形成溃疡，但部分地方尚可见完整的上皮钉突；7-8d，出现肉眼可辨的散在点状溃疡；镜下见鳞状上皮脱落形成溃疡，其下大量炎症细胞浸润，毛细血管扩张充血；9-12 d，点状溃疡逐渐融合，上皮剥脱；12-14 d，可看到溃疡加重，纤维渗出，形成假膜，到第14 d，所有受照射的部位形成连贯一致的溃疡，镜下见上皮结构完全崩解，形成较深溃疡，胶原纤维断裂，可见较多纤维性渗出覆盖溃疡表面，其内交织有大量炎症渗出细胞；第21 d，溃疡的周边开始出现愈合；镜下见溃疡底出现肉芽组织，可见大量炎症细胞，新生毛细血管及成纤维细胞，但炎症细胞较照射后5 d时明显减少，可见少量胶原纤维组织及大量新生毛细血管；第28-35 d，受照射的1×1cm2范围的溃疡由周边向内收拢愈合。镜下可见上皮结构重新出现，但上皮层明显变薄，黏膜下层仍有炎症细胞浸润，黏膜下毛细血管扩张充血，基底细胞呈梭状，排列紧密成栅栏状。外周血可检测到Ⅷ因子阳性的CECs，其体积较大，直径约10～50μrm，形态多样，大多为极不规则的多边形，易辨认。舌照射后3 d，外周血中CECs数量(单位：106个/L)为2.66±0.93；5 d为5.61±1.29；8 d为9.05±3.05；14 d为5.79±1.19；21 d为3.28±0.72；28 d为1.22±0.45；35 d为1.08±0.44。其变化趋势为3-5 d CECs增加明显，8 d达到高峰，14 d后逐渐下降，28-35d与对照组无统计学差异，5 d、8 d、14 d、21 d、28 d时CECs数量和大鼠放射性口腔黏膜炎指数(OMI)的相关系数R=0.93(P=0.000)。放射照射后的血管管腔变得明显不规则，管腔中可见有血栓形成，管腔内膜凹凸不平，血管扩张，管径变大，血管内皮细胞与基底膜分离脱落到管内，并可看到部分血管狭窄严重、闭塞。血管内皮细胞TUNEL检测到血管内皮细胞凋亡，5 d组凋亡内皮细胞百分数(％)为78.3±0.31；8 d组为89.3±0.83；14 d组为83.5±0.41；21 d组为69.3±0.57；28d组为47.3±0.59。5 d、8 d、14 d、21 d、28 d时CECs数量与大鼠舌组织血管内皮细胞凋亡百分比的相关系数R=0.67(P=0.034)。
　　 结论：成功建立了大鼠RTG模型，为研究ROM的病理机制提供了新的技术平台。CECs与RTG的病情相关，与局部病损组织内血管内皮细胞的损伤相关，提示CECs可能成为RTOM疾病活动性检测的指标。大鼠抗体芯片结合荧光定量PCR、ELISA技术可有效检测出RTG舌病损组织内的细胞因子变化，促凋亡蛋白Bax mRNA水平上调、抗凋亡因子Bcl-2的mRNA下降，促中性粒细胞募集相关因子IL-1α、CINC-2、CINC-3表达上调，血管形成相关等细胞因子没有显著变化，变化剧烈的细胞因子是IL-1α、CINC-3、INF-γ、和TIMP-1等4种细胞因子，其作用有待进一步研究。
　　 第二章：奥替普拉对放射性舌炎的预防效应与机制。
　　 目的：探讨奥替普拉(Oltipraz，OLT)对放射性舌炎的预防效应及其可能机制。
　　 方法：应用RTG大鼠模型，观察不同剂量(50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg)OLT,不同时点(照射前1 hr预防性给药、照射后5 d治疗性给药)RTG大鼠体重、OMI、出现溃疡的程度(OMI最高值)、出现溃疡的时间，分析上述指标与OLT剂量间的相关性。按OLT200rng/Kg，在照射前1 hr灌胃给药后，在不同观测时点(5 d、8 d、14 d)分别对RTG大鼠外周血中CECs计数、TUNEL检测大鼠舌体病损组织内血管内皮细胞凋亡，ELISA定量检测RTG病变组织的IL-1α、IFN-γ、TIMP-1时相动态变化水平。
　　 结果：在阳性对照组、50mg/Kg预防组、100mg/Kg预防组、200mg/Kg预防组、200mg/Kg治疗组五组间：①阳性对照组大鼠的体重下降最明显；三个预防组的大鼠体重变化与阳性对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。200mg/Kg治疗组大鼠的体重变化与阳性对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05);②三个预防组的OMI最高值分别为3.8±0.75、2.2±0.75、1.5±0.8，显著低于阳性对照组的OMI最高值(4.7±0.52)，差异具有统计学意义(P＜0.05)。而200mg/Kg治疗组的OMI最高值为4.7±0.49，与阳性对照组比较二者间的差异无统计学意义(P＞0.05)；③三个预防组出现口腔黏膜溃疡天数(days)分别为28.8±0.98、26.5±1.05、24.6±1.63，显著低于阳性对照组(29.7±1.03)比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。而200mg/Kg治疗组的出现口腔黏膜溃疡天数为29.8±1.17，与阳性对照组比较二者间的差异无统计学意义(P＞0.05)；④OLT在RTG的发病程度、病程时间等方面表现为预防效应(照射前1hr灌胃给药)，无明显的治疗效应(照射后5d给药)。⑤三个预防剂量(50mg/Kg、100mg/Kg、200mg/Kg)与出现的OMI最高值呈负相关(R=-0.785，P＜0.01)，与出现口腔黏膜溃疡天数呈负相关(R=-0.828，P＜0.01)。
　　 结论：放射照射前给予OLT，可降低放射引起的大鼠体重减轻，降低放射性舌炎的病情和缩短病程时间，预防效应与剂量相关，具有预防RTOM的应用前景。奥替普拉防护放射性舌炎的机制可能是通过保护放射性舌炎病损组织内血管内皮细胞，减少血管内皮细胞凋亡，使脱落到外周血的循环内皮细胞数降低以及调控炎症相关细胞因子。

目录

文摘

英文文摘

声明

引 言

第一章 SD大鼠放射性舌炎动物模型的建立与炎症反应特点

第一节 SD大鼠放射性舌炎动物模型的建立

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.小 结

第二节 放射性舌炎SD大鼠外周血中循环内皮细胞的检测及意义

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.小 结

第三节 放射性舌炎病损组织细胞因子的检测及意义

1.材料和方法

2.结 果

3.讨论

4.小 结

第二章 奥替普拉对放射性舌炎的预防效应与机制研究

第一节奥替普拉对放射性舌炎的预防效应

1.材料和方法

2.结 果

3.讨论

4.小结

第二节 奥替普拉预防放射性舌炎的机制探讨

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

4.小结

参考文献

全文总结

附件1 中英文对照词表

附件2 RayBio(R)大鼠细胞因子抗体芯片检测19种细胞因子原始图

附件3 有关荧光定量PCR检测的相关原始数据

附件4 综述实验性放射性口腔黏膜炎的研究进展

附件5 个人简历

致谢