骨肉瘤组织硒含量测定及硒甲基硒代半胱氨酸诱导骨肉瘤细胞系MG-63凋亡的实验研究

摘要

目的：研究骨肉瘤组织中硒含量；研究硒甲基硒代半胱氨酸(MSC)对人骨肉瘤细胞系MG—63的增殖抑制和凋亡诱导作用。 方法：收集8例骨肉瘤和10例非骨肉瘤的全血标本及14例骨肉瘤组织和该患者自身正常骨组织，采用氢化物原子荧光光谱法测定血液和组织中硒元素含量；利用WST-1法检测硒甲基硒代半胱氨酸(MSC)单独及联合盐酸吡柔比星对MG—63细胞的增殖抑制作用。倒置显微镜下观察MSC对MG—63细胞的形态学影响。Hoechst33342/PI双染在荧光显微镜下观察MG—63细胞在不同浓度的MSC作用下凋亡的形态学变化。流式细胞仪检测MSC对MG—63的细胞周期的影响。酶标法检测凋亡执行蛋白Caspase—3的活性。Western—blot检测凋亡抑制蛋白Bc1-2表达。 结果：①骨肉瘤组织中的硒含量为(0.082643±0.033587) mg/Kg，同一患者正常骨组织的硒含量为(0.033571±0.018131) mg/Kg，两者比较有明显的统计学差异(P<0.01)。②骨肉瘤患者全血中的硒含量为(0.09475±0.027855) mg/L，非骨肉瘤组全血的硒含量为(0.0822±0.035543) mg/L，两者比较无统计学差异(P>0.05)。③在不同浓度MSC(6.25μ mol/L，12.5μ mol/L,25μ mol/L，50μ mol/L，75μmol/L，100μ mol/L)作用48h后，WST-1法检测MG—63细胞的生长抑制率分别为(54.33±2.07)％,(60.79±2.25)％,(59.76±4.81)％,(58.82±7.25)％，(65.58±4.11)％，(69.07±0.14)％，结果有统计学差异，提示MSC对MG—63细胞生长抑制呈浓度依赖性。④用50μmol/LMSC处理MG—63细胞12h、48h、96h后，WST-1法检测生长抑制率分别为(24.04±0.50)％，(58，82±7.25)％，(84.90±3.90)％，结果有统计学差异，提示MSC对MG—63细胞生长抑制呈时间依赖性。⑤倒置显微镜下观察：MSC作用后，MG—63细胞变圆，细胞间距逐渐增大，变圆的细胞数量增多，可见到大部分细胞凋亡特征性的形态学变化，细胞皱缩，核固缩碎裂并有凋亡小体形成。50umol/L MSC处理MG—63细胞48h后，Hoechst/PI双染，荧光显微镜下观察到蓝染细胞增加明显而红染细胞增加不明显，呈低红高蓝，为凋亡的细胞图像。⑥流式细胞仪检测：MG—63细胞经50μ mol/L MSC处理48小时后，在周期图上G0期出现明显的亚二倍峰；72小时后亚二倍峰变宽，结果显示MSC能诱导MG—63细胞凋亡。50μ mol/L MSC处理48h、72h后处于的G0/G1期细胞分别为72.50％和92.0％，S期为23.6％和3.8％，G2/M期为5.8％和1.2％。处于G0/G1期的细胞所占比例增加，而处于S期、G2/M期的细胞所占比例减少，提示MG—63细胞被阻断在G0/G1期。⑦0、50μ mol/L、100μ mol/L MSC处理MG—63细胞24h后酶标法检测Caspase—3活性分别为(2.26±0.04)、(3.46±0.40)、(3.88±0.28)。与对照组相比，50μ mol/L、100μ mol/L MSC处理后，MG—63细胞的Caspase—3活性分别增加了(53.8％±3.23)％，(72.9±2.03)％，结果有统计学意义。⑧单独使用盐酸吡柔比星(THP)15μ g/ml处理48h后，WST-1法检测MG—63的细胞生长抑制率为(16.68±5.39)％。MSC50μ mol/L预处理细胞24h，换液后用THP15μ g/ml再处理24h，WST-1法检测MG—63细胞的抑制率为(80.41±3.51)％，结果有统计学差异，提示MSC与THP联合作用较THP单独对MG—63的抑制作用更为明显。 结论：⑴骨肉瘤组织中硒含量明显高于自身正常骨组织，提示骨肉瘤的发生可能与硒含量有关。⑵硒甲基硒代半胱氨酸对骨肉瘤细胞系MG—63具有增殖抑制和凋亡诱导作用，并且呈时间和剂量依赖，其机制可能为凋亡抑制蛋白Bc1-2下调，启动内源性线粒体通路，激活凋亡执行蛋白Caspase—3，诱导凋亡。⑶硒甲基硒代半胱氨酸与盐酸吡柔比星协同抑制骨肉瘤细胞MG—63增殖，提示MSC可望成为骨肉瘤化疗的辅助药物。

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