干细胞在全身放射大鼠的分布及局部脑放射的MR成像研究

摘要

放射治疗是临床肿瘤治疗中常用的手段之一，随着患者生存率的提高及治疗技术的进步，医生及患者越来越关心长期生存病人的生活质量问题。放射损伤引起的放疗后遗症严重影响了患者的生活质量，严重会导致病人痴呆、瘫痪甚至危及生命。但目前，放射性损伤尚无有效的治疗手段，故探讨放射损伤机理，寻找有效的治疗方法，是减少放疗后遗症，提高患者生存质量的关键。干细胞是放射损伤最有希望的治疗方法之一。干细胞是一类具有广泛增殖能力和多向分化潜能的细胞，在一定条件下，可以分化为不同的组织，在动物生长、维持机体稳定和组织再生修复中起着重要作用。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有多向分化的能力，在一定的环境条件下，可以分化成中胚层细胞如成骨细胞、成软骨细胞、内皮细胞、心肌细胞和脂肪细胞等，还能分化成非中胚层细胞如神经元、神经胶质细胞等。MSCs还具有独特的免疫表型和免疫调节能力，在体内和体外均表现出一定的免疫抑制作用，因此，MSCs被广泛应用组织损伤修复、组织工程和器官移植免疫治疗等方面，部分已进入临床试验，取得了一定效果。神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是另一个治疗组织损伤常用的细胞，在神经系统损伤中有广泛的用途。神经干细胞具有增殖特性，通过对称分裂和不对称分裂满足神经系统的更新需要，具有分化特性及可塑性，可以分化为神经系统的各种细胞，还具有跨系或跨胚层分化的潜能。用MSCs及NSCs治疗各种组织损伤及神经系统损伤的研究已大量开展，多数取得了一定的效果。但用干细胞治疗组织损伤的机理尚未完全清楚。多数认为与干细胞可以通过分化为组织细胞，分泌细胞因子改善损伤环境，阻止细胞凋亡等方面有关。这其中，人们首先关心的是干细胞在损伤组织中的分布及迁移情况，通过组织学及分子影像医学显示干细胞在体内的分布迁移，对研究干细胞的治疗机理及治疗效果具有重要意义。研究表明，干细胞具有向损伤组织定向迁移的特性，称为趋化性，干细胞的趋化性同很多因素有关，主要与损伤组织产生趋化因子及各种黏附分子、受体配体的相互作用有关。目前已开展了大量的用影像学方法无创伤性的、直观的显示干细胞在体内的分布及迁移的研究，其中，用超顺磁性氧化铁标记干细胞，用MR活体示踪干细胞的方法开展的较多，并取得了较好的效果。我们在研究中，首先用RT—PCR方法研究MSCs在全身照射大鼠体内的分布及随放射剂量变化而改变的情况，然后用SPIO标记神经干细胞，研究干细胞在放射性半脑模型中的迁移情况，为进一步研究干细胞的治疗打下基础。 研究目的与意义： 1.用荧光定量RT—PCR方法探讨骨髓间充质干细胞在大鼠经过全身照射后其体内分布的状况，为进一步研究骨髓间充质干细胞（MSCs）对正常组织器官放射性损伤的治疗提供理论依据。 2.用超顺磁性氧化铁在体外标记神经干细胞，移植到半脑放疗的大鼠脑内，用MR显示干细胞在半脑放射大鼠脑内的成像及分布迁移情况。 本研究分两部分： 第一部分骨髓间充质干细胞在全身照射大鼠体内分布实验研究 方法：培养MSCs细胞，用绿色荧光蛋白标记。分别对大鼠行全身照射及全身照射+全脑照射，经尾静脉注入标记的MSCs，荧光显微镜观察MSCs在各器官的分布，荧光定量RT—PCR检测MSCs在不同组织器官的分布。结果：获得绿色荧光标记MSCs，经尾静脉注入各实验组大鼠体内后显示，未行照射时MSCs仅少量分布在肺、骨髓、脾中；6Gy全身照射后各器官MSCs的分布明显增加，小肠、骨髓等早反应组织增加的更显著；7Gy全身照射进一步增加了各器官MSCs数量；6Gy全身照射+全脑照射20Gy后MSCs在大脑的分布明显增多，在其他器官的发布也明显增加。 第二部分超顺磁性氧化铁标记神经干细胞在放射性脑损伤大鼠的磁共振成像研究 方法：培养神经干细胞，制作大鼠左右半脑及前后半脑放射损伤模型，在体外用不同浓度的超顺磁性氧化铁标记神经干细胞，用MR显像，研究不同浓度SPIO的标记率、细胞活力及最佳成像浓度。将标记的神经干细胞用立体定向仪植入大鼠体内，不同时间行MR检查，了解干细胞的成像情况及在放射后大鼠脑内的分布迁移。结果：成功获得神经干细胞，经不同浓度SPIO标记后，细胞标记率都在90％以上，20～200ug/ml的SPIO对细胞存活率均未造成明显影响，浓度为100 ug/ml的SPIO取得了较好成像效果。成功获得大鼠左右半脑及前后半脑放射损伤模型，将标记SPIO的神经干细胞分别移植到左半脑及前半脑后，获得清晰的MR图像，移植后可以发现右半脑放射模型中，干细胞向右侧移动，后半脑放射模型中，干细胞向后移动，标记干细胞的MR成像可以持续一个月以上。 结论： 1.放射损伤可诱导MSCs产生趋化作用，MSCs在各器官分布随照射剂量及放射损伤程度增加而增多，局部照射可增加局部及其他器官MSCs分布。 2.浓度为100 ug/ml的SPIO标记神经干细胞在体内和体外可以获得较好MR成像效果，移植到半脑放射损伤模型中，MR可以清晰显示干细胞分布，追踪观察显示干细胞有向放射区域迁移的趋势，SPIO标记的干细胞在大鼠脑内的成像可以持续1个月以上。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

第一部分骨髓间充质干细胞在全身照射大鼠体内分布实验研究

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

第二部分超顺磁性氧化铁标记神经干细胞对放射性脑损伤大鼠的磁共振成像研究

材料与方法

结 果

讨 论

结论

参考文献

附录1 攻读博士期间发表的文章及参与的科研

致谢