脱细胞脑组织修复支架的研制及其生物相容性研究

摘要

目的： 研制交联型天然脱细胞脑组织修复支架，并分析、评估其形态结构、主要成分、生物相容性，为研制出理想的脑损伤修复支架提供初步的实验依据。 方法：1.脱细胞脑组织修复支架制备：(1)13月龄健康Sprague—Dawley(SD)成年大鼠10只，雌雄不限，体重为180±20g。消毒、麻醉后取出大鼠大脑，分离出脑皮质后，运用冻融、低渗、Triton X-100、脱氧胆酸钠、DNA/RNA酶及Genipin交联等方法处理，初步制成交联型脱细胞脑组织修复支架。(2)支架材料的形态结构观察：解剖显微镜下观察脱细胞脑组织修复支架制备过程中形态变化；并分别通过光学显微镜和扫描电镜观察支架材料内部结构特征和三维立体构型。(3)细胞外基质成分分析：通过免疫组化的两种方法对比正常脑组织和脱细胞脑组织修复支架中三种主要的细胞外基质FN、LN和ColⅣ的含量和分布情况。2.脱细胞脑组织修复支架的生物相容性研究：(1)组织相容性：3月龄健康Sprague—Dawley(SD)成年大鼠52只，雌性，体重为180±20g。随机将动物分为假手术组(阴性对照，4只)、新鲜脑组织组(阳性对照，12只)、明胶海绵组(12只)、脱细胞支架组(12只)、交联型天然脱细胞脑组织修复支架组(12只)；将样本植入SD大鼠背部肌肉，于试验后1周、2周、4周、12周处死动物，切取样品及其周围0.5～1 cm肌肉组织。对标本进行HE染色观察炎症反应及炎症细胞浸润程度。(2)细胞相容性：神经干细胞单层培养；取出生1天内SD大鼠6只，雌雄不限，取出神经干细胞，在Gage和Ray方法的基础上，改良单层培养细胞；倒置相差显微镜每天观察细胞生长变化，并通过免疫荧光染色方法鉴定细胞类型及增殖情况。(3)细胞相容性检测：将支架和神经干细胞、神经细胞、SD大鼠肺成纤维细胞共培养1周观察支架的毒性反应；用支架浸提液(1：1和1：2)培养神经干细胞1周，通过MTT方法观察细胞生长增殖情况，以神经干单层培养基(DMEM/F12+N2+bFGF)培养神经干细胞作为阳性对照，DMSO做空白对照；将神经干细胞种植于交联型脱细胞脑组织支架，1周后通过光镜和电镜观察细胞在支架上的生长增殖以及与支架材料的粘附情况。 结果： 1.脱细胞脑组织修复支架制备。(1)支架的形态结构：成年SD大鼠新鲜脑组织经脱细胞处理后，细胞成分已去除，形态上具有高度仿生的三维立体空间网状结构，亲水性良好。经Genipin交联后支架材料空间网状结构变得更为明显，无菌保留3个月未见明显降解，未见明显细胞碎屑残留。孔洞形态相似，孔径大小相近，平均孔径14.85±2.51μm，孔隙率达90.44％±2.16％。(2)细胞外基质成分免疫组化分析：正常脑组织中细胞外基质成分LN有强阳性表达，FN有阳性表达，而ColⅣ为弱阳性表达，主要分布于脑内血管的基底膜上。经过脱细胞处理后的修复支架材料LN仍有强阳性表达、FN和ColⅣ均为弱阳性表达。 2.脱细胞脑组织修复支架的生物相容性研究。(1)组织相容性(肌肉植入试验)：所有大鼠均顺利成活，无死亡，麻醉清醒后即可自由活动。饮食正常，大小便正常。假手术组在术后1周仅见少量淋巴细胞，1周后未见炎症细胞。新鲜脑组织组术后第3天，1周、4周、12周试样周围均可见以嗜中性粒细胞浸润为主的炎症反应，可见大量毛细血管和小血管生成。未交联脑组织支架组在术后3天可见少量中性粒细胞，并可见少量毛细血管生成。术后1周、4周可见少量淋巴细胞，毛细血管未见明显增多；12周仅见少量淋巴细胞。明胶海绵组和交联脱细胞脑组织支架组术后第3天、1周、4周试样周围有少量淋巴细胞。12周时淋巴细胞明显较前减少。按照GB/T14233.2-93炎症细胞反应分级结果显示交联脱细胞脑组织支架组反应程度符合国标要求，短期肌肉植入试验合格。(2)脱细胞脑组织修复支架的细胞相容性。神经干细胞单层培养：神经干细胞单层培养易于得到单个神经干细胞，通过免疫荧光检测，结果表明：神经巢蛋白(Neuroepithelial Stem Cell Protein，Nestin)阳性率83％，胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP)阳性率1.8％，神经元特异性烯醇化酶(Neuro-specific enolase，NSE)阳性率95％，5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-1-(2-deoxy—β—D—ribofuranosyl)uracil，BrdU)(+)。(3)细胞相容性：交联支架与神经干细胞、成纤维细胞共培养1周，细胞形态无明显改变，并可见细胞增殖；神经细胞与支架共培养1周未见明显死亡。支架浸提液(1：1和1：2)培养和完全培养基培养神经干细胞1周，MTT结果显示三组间无明显差异(P=0.128)，细胞生长未受明显抑制。神经干细胞与交联支架材料静态共培养时，细胞增殖良好，7天时大量神经干细胞与支架粘附，部分增殖成神经球；HE可见细胞外基质间大量细胞粘附；扫描电镜下同样可见大量神经干细胞粘附在材料表面，部分细胞有突起生长。 结论：1.初步研制的脱细胞脑组织支架立体空间网状结构，部分保留了细胞外基质成分，生物相容性良好。2.改良单层培养法可成功培养神经干细胞，为实验提供高产量单个神经干细胞。3.神经干细胞可在修复支架上生长、增殖，为修复支架应用于脑损伤修复研究提供了初步的实验基础。

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讨 论

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