侵袭性T细胞淋巴瘤自体造血干细胞移植后随访结果和CD4+CD25+Treg细胞调节异基因移植后GVHD和GVL的实验研究

摘要

研究目的:外周T细胞淋巴瘤是发生率相对较低同时又是异质性明显的一组非霍奇金淋巴瘤。亚洲地区发病率高于欧美。与B细胞淋巴瘤相比，临床诊断时，PTCL病程相对较晚期，PS评分高，结外病变、B症状、LDH比例高、骨髓侵犯多见。因此PTCL预后比B细胞淋巴瘤差，表现为化疗有效率低，复发率高，总生存时间短。由于缺乏PTCL各种亚型的前瞻性临床研究结果指导，目前PTCL的治疗策略主要借鉴B细胞淋巴瘤的经验。标准剂量的CHOP方案仅能治愈少数早期的PTCL患者，但对大部分PTCL患者而言，目前其治愈率仍很低。采用高剂量强度方案治疗PTCL，其无进展生存和总生存上并未明显超越标准剂量的CHOP方案。如类似儿童Burkitt淋巴瘤的强烈治疗方案只是提高了总有效率，而并未明显延长无事件生存。由较新细胞毒药物如吉西他滨、喷妥司汀、拓扑替康等组成的方案，显示一定疗效，但仍在初步的临床研究中。由于PTCL分化和抗原表达的异质性，单克隆抗体治疗包括CD2，CD4，CD5，CD7，CD25，CD30和CD52等，只能针对相应的PTCL亚型，而且仍在研究当中。目前因缺乏前瞻性、随机对照的大规模临床试验结果，自体造血干细胞移植(AHSCT)治疗PTCL尽管取得了明显的进步，但其临床作用仍未明确，大部分回顾性临床研究认为复发难治性的PTCL在AHSCT治疗后可以获得优于常规挽救化疗方案的治疗效果，因此，多数医生考虑下列治疗选择，不管ALK状态，PTCL复发后均应考虑接收AHSCT治疗的。而对于ALK—的初治PTCL，尤其具是2个以上有不良预后因素(a—IPI2～3分者及B2-MG升高)者，推荐一线尝试采用AHSCT治疗，并进一步考察AHSCT在PTCL中的作用。回顾性临床研究显示AHSCT可以为PTCL带来生存受益，但仍有约23～59％移植后评价CR的患者复发。同时也有初步的资料显示allo—HSCT可能为病程较晚、既往复杂治疗和(或)骨髓侵犯的患者带来PFS和OS的益处。对于一线或挽救性AHSCT失败后患者，可考虑选用传统或减低预处理强度的异基因HSCT的临床试验。 allo—HSCT的优点是输入移植物无淋巴瘤污染，并有潜在的移植物抗淋巴瘤(GVL)效应。但清髓性移植后的生存因较高的非复发死亡率而受影响，主要原因是移植物抗宿主病(GVHD)。同时GVL带来的有效性常伴随对宿主正常组织有害的GVHD反应。因此目前异基因移植的焦点是将有效的GVL效应与GVHD分离。我们复习文献发现能明确抑制GVHD同时保留GVL作用的策略包括T调节细胞的输注，新型药物和生物制剂的使用。 西罗莫司(Sirolimus)是一种哺乳类雷帕霉素靶分子(mTOR)抑制剂，西罗莫司与FK结合蛋白12(FKBP12)、mTOR蛋白结合形成复合物。这种西罗莫司—FK蛋白12-mTOR复合物抑制几条旁路，导致DNA转录、DNA翻译、蛋白质合成减少、细胞周期阻滞，并导致T细胞的免疫抑制和树突状细胞的功能受损。此外在动物实验中，西罗莫司可以扩增CD4+CD25+Foxp3调节T细胞，且GVL未受影响。 抗CD25单抗是一种新型免疫抑制剂，可以与α链结合后可阻滞活化T细胞上的高亲和力IL—2受体，并抑制IL—2介导的IL—2受体依赖性的激活通路。阻滞IL—2对淋巴细胞的活化和增值作用可能是其作用的主要机制。 活化的CD4+CD25+Treg细胞通过以下机制发挥其抑制效应T细胞的作用：与抗原提呈细胞的功能、直接接触抑制作用于效应性T细胞、分泌可溶性细胞因子，如IL-10、TGF—β等。在小鼠的异基因模型中发现，输注CD4+CD25+Treg细胞可以抑制急性GVHD反应和移植物排斥反应同时保留GVL作用，当剔除CD4+CD25+Treg细胞时可放大GVHD反应。 总而言之，西罗莫司、抗CD25单抗、CD4+CD25+Treg都有抑制GVHD同时保留GVL的潜在优势。本研究拟比较中三者疗效的优劣。 方法与结果: 第一部分：侵袭性T细胞性淋巴瘤自体造血干细胞移植后随访结果评价自体造血干细胞移植(Autologoushematopoieticstemcelltransplantation，AHSCT)治疗侵袭性T细胞性非霍奇金淋巴瘤(T—NHL)的临床疗效及安全性。 本文回顾性分析1994年～2008年间，我院收治的AHSCT治疗后长期随访的侵袭性T—NHL36例，初治11例(30.6％)，复发11例(30.6％)和难治性病例14例(38.9％)。病理类型包括T淋巴母细胞淋巴瘤16例(44.4％)、间变大细胞性淋巴瘤8例(22.2％)和外周T非特异型淋巴瘤5例(13.9％)。 36例患者接收自体造血干细胞移植，35例患者可评价疗效，1例移植后失访。中位随访23(8-132)月，中位无进展生存时间(PFS)38.7个月，预计1年、3年和5年无进展生存率分别为56％，46％和46％。预计中位总生存时间54月，1年、3年和5年总生存率分别为69％，58％，49％。移植后17例(48.6％)患者复发，4例患者仍带瘤生存。移植前为难治性病例和骨髓侵犯是本组患者不良预后相关的因素。主要Ⅲ～Ⅳ度不良反应为发热(51.6％)、口腔溃疡(32.3％)；1例治疗相关死亡。 第二部分：CD4+CD25+Treg细胞调节异基因移植后的GVHD和GVL的实验研究 第一章：GVHD模型及肿瘤模型的建立； 方法： 步骤1：雌性C57/BL6(H2Kb)受鼠接受致死剂量12Gy的放疗，并在放疗24小时内尾静脉注射来源于异基因供鼠BALB/c(H2Kd)不同数量级的骨髓细胞。 结果1:5.0×106的骨髓细胞是移植成功的最低限。 步骤2：受鼠接受致死剂量的放疗后，接受异基因供鼠来源的骨髓细胞和不同数量级的脾淋巴细胞的共同移植。 结果2：脾淋巴细胞的比例和数量是调节GVHD程度的重要因素。35×106是造成致死性GVHD的最低剂量。 步骤3：正常小鼠和放疗后小鼠皮下分别接种不同数量的淋巴瘤细胞。 结果3:107的淋巴瘤细胞是正常小鼠成瘤的最低剂量。105的细胞可以使放疗后的小鼠成瘤。 步骤4：受鼠接受致死剂量的放疗后2小时内，予或不予皮下接种肿瘤细胞株，并予异基因骨髓细胞和脾淋巴细胞的共同移植。 结果4：单纯移植的小鼠长期存活超过90天，接种淋巴瘤细胞的小鼠移植后因肿瘤进展死亡，死亡时无GVHD反应，中位生存时间26天。 第二章：CD4+CD25+Treg细胞的分离纯化和体外功能测定； 方法： CD4+CD25+Treg细胞是脾淋巴细胞单个核悬液用CD25-PE抗体和与PE结合的磁珠通过全自动磁珠分选(AutoMACS)系统浓缩后得到。用流式细胞仪检测与FITC、PE抗体结合的CD69，CTLA—4和CD45RO。用MTT法检测CD4+CD25+Treg细胞队混合淋巴细胞的影响。 结果： ①CD4+CD25+Treg的纯度常规可达80.5％以上。流式测定CD4+CD25+TregCD69的表达为2.9％，CD45RO的表达为90.5％，CTLA—4的表达为91.2％。 ②在CD4+CD25+Treg细胞与混合淋巴细胞比例为1:1时，抑制率为49.33％。 第三章：西罗莫司、抗CD25抗体、CD4+CD25+Treg细胞调节异基因移植后GVHD和GVL的试验研究 方法：A、B、C、D组受鼠接受致死剂量放疗后2小时内皮下接种肿瘤细胞株，并予异基因骨髓细胞和脾细胞共同移植。B、C、D组分别予西罗莫司、抗CD25抗体、CD4+CD25+Treg细胞治疗。E组为未加脾细胞和其他治疗的单纯骨髓细胞移植。 结果： ①CD4+CD25+Treg细胞治疗的D组生存时间超过60天，可明显抑制致死性GVHD反应，延长肿瘤的形成，且肿瘤体积为最小。 ②B组、C组中位生存时间分别是33和42天。抗CD25抗体抑制GVHD似乎更优于西罗莫司，但2组的小鼠大部分死于肿瘤进展。 结论: 1.AHSCT治疗初治晚期或常规化疗后复发的外周T细胞淋巴瘤是安全有效的，但复发率仍偏高，值得开展大规模的临床试验进一步深入研究2.CD4+CD25+Treg细胞可以明显抑制GVHD，并有部分GVL作用。 3.西罗莫司可有效抑制致死性GVHD。 4.抗CD25抗体亦能较好抑制致死性GVHD反应。 5.CD4+CD25+Treg细胞抑制GVHD，优于西罗莫司和抗CD25抗体。 6.抗CD25抗体抑制GVHD优于西罗莫司，二者均未观察到GVHD与GVL分离的现象，但有延迟肿瘤生长的倾向，需进一步实验验证。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分侵袭性T细胞淋巴瘤自体干细胞移植后长期随访结果

前 言

1.病例与方法

2.结 果

3.讨 论

第二部分CD4+CD25+Treg细胞调节异基因移植后GVHD和GVL实验研究

前言

第一章异基因移植模型及荷瘤模型的建立

1.1实验材料

1.2实验方法

1.3观察指标

1.4实验结果

第2章CD4+CD25+Treg细胞的分离纯化及功能检测

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3实验结果

第3章 西罗莫司、抗CD25抗体、CD4l+CD25+Treg细胞调节异基因移植的GVHD和GVT的研究

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3观察指标

3.4实验结果

讨 论

结 论

参考文献

结果附图

附录

致 谢