甲型血友病基因诊断及产前基因诊断的研究

摘要

目的：建立利用DHPLC技术筛查非倒位患者14外显子点突变的方法来提高甲型血友病的基因诊断及产前基因诊断率，防止新患儿出生、降低该病发病率，减轻家庭和社会负担，对优生优育有深远意义。 方法：本研究收集了14个无血缘关系的HA家系，其中3例取得胎儿脐静脉血作产前诊断，5例家系符合连锁分析条件。常规使用饱和酚—氯仿方法提取血液标本DNA。我们优化并改良了Ⅰ—PCR技术并利用改良后的Ⅰ—PCR技术检测成人及脐血DNA的第22内含子倒位突变，非倒位突变的患者采用DHPLC技术对发生点突变率最高的14外显子进行点突变的筛查，最后对未能检测突变又符合连锁分析条件的，联合BclⅠ、HindⅢ及St14(DXS52)位点作连锁分析。 结果：利用改良后的Ⅰ—PCR技术在5个家系中检出了5名患者存在第22内含子倒位，联合临床的脐静脉血凝血因子检测方法为其中2例孕妇进行产前基因诊断，检出2例正常男性胎儿，两胎儿出生后均证实符合产前诊断。采用DHPLC技术14外显子点突变的筛查后，发现了2家系带有14外显子突变，其中一例为新发突变(c.3168-c.3187，del AAAGTGACACTGAGTTTAAA)，该家系胎儿产前诊断为患儿，已作人工流产终止妊娠。最后联合BclⅠ、HindⅢ及St14(DXS52)位点作连锁分析，5例家系中有2个家系能提供多态性信息，成功为相关家系成员作携带者诊断，为以后产前诊断提供了依据。 结论：本研究改良并优化了Ⅰ—PCR技术的技术条件，缩短检测时间从56小时缩短到44小时，使得该技术更简便、快捷，易于重复。应用改良后的倒位PCR技术可以快速有效地进行甲型血友病基因第22内含子倒位突变的检测和产前基因诊断，三天以内发出报告。我们还是国际上首次利用DHPLC技术应用于HA的产前基因诊断，为该病的产前基因诊断提供了一种高效快速的检测方法。本研究联合应用Ⅰ—PCR技术、DHPLC技术及连锁分析方法为14个甲型血友病家系中的9个家系作出了基因诊断，诊断率约64％，联合应用多种方法可提高甲型血友病基因诊断率。本研究创立了本教研组对甲型血友病基因诊断的方法体系，提出了该病基因诊断更科学的方案：联合应用Ⅰ—PCR技术、DHPLC技术及连锁分析方法来提高甲型血友病基因诊断率。

目录

文摘

英文文摘

声明

引 言

第1章实验材料

1.1研究对象

1.2主要试剂

1.3主要实验仪器

第2章实验方法

2.1外周血样本基因组DNA的制备

2.2胎儿脐静脉血处理

2.3改良的倒位PCR检测

2.4 DHPLC筛查

2.5连锁分析

第3章实验结果

3.1改良的I-PGR技术检测结果

3.2 DHPLC筛查及DNA测序结果

3.3连锁分析结果

3.4产前基因诊断结果

第4章讨论

4.1检测FⅧ第22内含子倒位与产前诊断

4.2非倒位突变的检测

4.3产前诊断技术的选择

第五章结论

参考文献

攻读学位期间发表的文章

致 谢