NADPH氧化酶DUOX1、DUOX2和NOX4在肝细胞癌中的表达及临床意义

摘要

研究背景: 肝细胞性肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是目前发病率高、治疗困难、死亡率高的恶性肿瘤，全球每年约有598000人死于肝癌。我国肝癌的死亡率在所有恶性肿瘤中居第二位，年死于肝癌的人数占全世界肝癌年死亡总数的53％。虽然肝癌的诊断和治疗有了长足的进步，但生存率在总体水平上没有明显提高。因此对肝癌发病机制的深入研究对肝癌的发生、发展、转移，乃至诊断、治疗、预后均具有重要的意义。 NADPH氧化酶家族（包括NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2）是一组具有组织特异性分布的酶类，参与宿主防御、炎症反应、细胞信号传递、基因表达、调节细胞生长、调节细胞内氧化还原电位等。NADPH氧化酶具有传递电子以及催化产生活性氧簇（ROS）的作用。最近发现NADPH氧化酶在多种肿瘤细胞系中表达，在多种肿瘤组织中有表达并且在肿瘤组织中表达水平要高于组织来源相同的正常组织。NADPH氧化酶在不同的肿瘤中表达，通过其催化产生的ROS直接作用或诱导一系列细胞因子，导致肿瘤发生、血管生成、肿瘤增殖、肿瘤转移以及调节细胞周期、抑制肿瘤细胞凋亡等作用。ROS主要由NADPH氧化酶催化产生，主要包括超氧负离子、过氧化氢、及氢氧根离子等由氧衍生的小分子物质。ROS本身具有的强氧化性可产生过氧化损伤，导致DNA、蛋白质和脂质的损伤，正常情况下可产生杀灭入侵机体的微生物。NADPH氧化酶催化产生的ROS参与肿瘤发生、肿瘤血管生成、肿瘤增殖和转移的一系列过程中，同时ROS还可以诱导多种细胞因子间接参与肿瘤发生、发展进程、调节肿瘤细胞有丝分裂等。 DUOX基因（包括DUOX1和DUOX2）属于NADPH氧化酶家族，主要在甲状腺和呼吸道上皮中表达，DUOX与其他几种NADPH氧化酶不同的是，DUOX在甲状腺癌和肺癌中表达明显低于癌旁正常组织，并且发现肺癌中DUOX基因甲基化导致DUOX基因在肺癌中沉默。NOX4是另一种NADPH氧化酶基因，在多种癌细胞系和肿瘤组织中表达，并可以通过其催化产生的ROS参与肿瘤生长进程。 研究目的: 1、研究肝细胞癌中DUOX1、DUOX2和NOX4mRNA的表达状况。 2、探讨DUOX1、DUOX2和NOX4mRNA表达与肝癌患者临床病理指标及术后生存的关系。 材料和方法: 肝癌细胞系HepG2、Hep3B、SMMC—7721、ChangLiver、BEL7402、MHCC—97H及MHCC—97L和1株正常肝细胞系LO2，购自上海细胞研究所。在含有10％胎牛血清和青、链霉素双抗的RPMI1640培养基中，37℃恒温培养箱中连续传代培养。细胞培养至对数生长期时提取基因组RNA。 连续选择2003年1月至2006年12月间中山大学肿瘤医院肝胆科手术切除的肝癌组织和匹配的癌旁无瘤肝组织各107例，以及本实验室近3年来保存的30例正常无肝硬化的肝血管瘤或FNH瘤旁肝组织（其中肝血管瘤18例，FNH12例），全部标本均经组织学确诊。所有标本经RNAlater处理后，—80℃保存。所有患者术前均未接受放射治疗或化学治疗，临床病理资料和随访资料完整，末次随访时间至2009年4月，无失访病例。 RT—PCR（ReverseTranscriptase—PCR）检测DUOX1、DUOX2和NOX4基因mRNA在7种肝癌细胞系、1种正常肝细胞系、30例正常肝组织、107例肝细胞癌组织及匹配的癌旁肝组织中的表达。共选择16项可能对手术预后产生影响的临床病理相关指标，包括患者性别、年龄、HBsAg状态、术前CHILD—PUGH分级、有无血小板减少症、GGT、术前AFP水平、肿瘤最大径、有无卫星结节、肿瘤包膜情况、有无门静脉癌栓、切缘、术中失血量、术中肝硬化分级、术后病理分级和TNM分期，以及DUOX1、DUOX2基因和NOX4基因mRNA在肝癌组织中的表达情况，将以上资料输入计算机数据库并进行等级划分或量化。组间比较采用X2检验或Fisher精确概率法。生存率按Kaplan-Meier法计算，单因素分析采用Kaplan—Meierlog—rank检验，单因素分析有意义的变量引入Cox模型行多因素分析。P<0.05认为有统计学意义。运用SPSS15.0软件进行统计分析。 结果: 1.RT-PCR检测发现DUOX1mRNA在具有转移潜能的肝癌细胞系MHCC—97H和MHCC—97L中高表达，在BEL7402细胞系中相对低表达，其余4株肝癌细胞系HepG2、Hep3B、SMMC—7721、ChangLiver和正常肝细胞系LO2中无表达。DUOX2mRNA也在具有转移潜能的肝癌细胞系MHCC—97H和MHCC—97L中高表达，在SMMC—7721细胞系中相对低表达，其余4株肝癌细胞系HepG2、Hep3B、ChangLiver、BEL7402和正常肝细胞系LO2中无表达。NOX4mRNA仅在SMMC—7721细胞系中表达，在其余肝癌细胞系和正常肝细胞系中无表达。 2.DUOX1、DUOX2和NOX4mRNA在肝癌组织中的表达均高于癌旁肝组织，表达差异均具有统计学意义（P=0.000）。30例正常肝组织中均无DUOX1、DUOX2和NOX4mRNA表达。 3.DUOX1和DUOX2mRNA在肝癌组织中的表达均与术前有无血小板减少有关（P值分别为：0.005和0.046），DUOX1和DUOX2mRNA阳性表达组肝癌患者术前发生血小板减少的比例较低；NOX4mRNA在肝癌组织中的表达与术前AFP水平（P=0.045）、有无卫星结节（P=0.025）有关，NOX4mRNA阳性表达组的肝癌患者术前AFP水平较高，伴有卫星结节的比例较高。 4.单因素分析显示肿瘤最大径>5cm、伴静脉癌栓、切缘<1cm、术中失血量>400ml、病理分级≥Ⅲ级、TNM分期≥Ⅱ期、DUOX1mRNA和DUOX2mRNA在肝癌组织中阳性表达预示相对较短的术后无瘤生存时间；而GGT>50U/L、肿瘤最大径>5cm.伴静脉癌栓、切缘<1cm、术中失血量>400ml、病理分级≥Ⅲ级、TNM分期≥Ⅱ期、DUOX1mRNA和DUOX2mRNA在肝癌组织中阳性表达预示相对较短的术后总体生存时间。DUOX1mRNA阳性表达组的肝癌患者术后无瘤生存率（P=0.020）和总体生存率（P=0.016）均低于DUOX1mRNA阴性表达组，差异具有统计学意义；DUOX2mRNA阳性表达组的肝癌患者术后无瘤生存率（P=0.007）和总体生存率（P=0.013）也均低于DUOX2mRNA阴性表达组，差异也均具有统计学意义。此外，NOX4mRNA阳性表达组的肝癌患者术后无瘤生存率（P=0.060）和总体生存率（P=0.089）均低于NOX4mRNA阴性表达组，但差异尚未达到具有统计学意义。 多因素分析表明影响术后无瘤生存率的独立预后因素为：肿瘤最大径（P=0.002）、切缘（P=0.011）、病理分级（P=0.003）、DUOX1mRNA（P=0.045）和DUOX2mRNA（P=0.023）的表达状态；影响术后总体生存率的独立预后因素为：肿瘤最大径（P=0.009）、有无门静脉癌栓（P=0.028）、切缘（P=0.009）、病理分级（P=0.003）、TNM分期（P=0.046）、DUOX1mRNA（P=0.013）和DUOX2mRNA（P=0.036）的表达状态。DUOX1和DUOX2mRNA在肝癌组织中的表达状态均是肝癌术后无瘤生存和总体生存的独立预后因素。 结论: 1、DUOX1、DUOX2和NOX4在肝癌中异常表达，和肝癌的发生、发展有关。 2、DUOX1和DUOX2在肝癌组织中的表达状态是肝癌术后生存的独立预后因素。 3、DUOX1和DUOX2在肝癌中表达状况相近，可能有相同的激活机制。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词汇表

声明

第一章前言

1、肝癌概述

2、 NADPH氧化酶与肿瘤

3、 ROS与肿瘤

4、 DUOX1、DUOX2和NOX4与肿瘤

第二章材料与方法

2.1材料

2.2方法

2.3统计学分析

第三章结果

3.1 DUOX1、DUOX2和NOX4在肝细胞系中的表达

3.2 DUOX1、DUOX2和NOX4在正常肝组织中的表达

3.3 DUOX1、DUOX2和NOX4在肝癌组织和癌旁肝组织中的表达

3.4 DUXO1、DUOX2和NOX4之间表达的相关性

3.5 DUOX1、DUOX2和NOX4表达与临床病理因素之间的关系

3.6 DUOX1、DUOX2和NOX4表达对肝癌术后生存的预测价值

第四章讨论

结论

参考文献

致谢