PSCA抗体靶向纳米探针MR成像早期诊断前列腺癌的研究

摘要

本课题内容分为三部分：
　　 1.相关纳米材料的合成及其理化性质表征
　　 2.PSCA抗体靶向纳米MRI显像探针scAbPSCA-PEG-g-PEI-SPIO构建
　　 3.PSCA抗体靶向纳米MRI显像探针早期诊断PCa体外细胞实验研究
　　 第一部分相关纳米材料的合成及其理化性质表征
　　 目的：化学合成相关材料及可降解性生物活性磁性纳米材料mPEG-g-PEI-SPIO，确定其理化特性。
　　 材料与方法：
　　 1α-羟基-ω-氨基聚乙二醇(HO-PEG-NH2)的合成
　　 真空干燥萘后加入THF，待萘溶解后迅速加入金属钾；把萘钾溶液移入乙醇胺中，待反应颜色变为深红色，迅速把溶液转移入18-冠-6醚的反应体系中，反应瓶置于冰盐浴；加入盐酸调pH值至4.5，粗产物沉淀在正己烷，再在无水乙醚中沉淀，过滤后再用无水乙醚洗涤产物，得到白色粉末状固体。
　　 2α-羟基-ω-马来酰亚胺聚乙二醇(mal-PEG-OH)的合成
　　 将NH2-PEG-OH(Mn=3.6kDa)溶解于NaCO3饱和溶液，冷至0℃，向其中加入N-甲氧基羰基马来酰亚胺和蒸馏水并搅拌，用0.5M的硫酸溶液调节pH到3.0，二氯甲烷萃取并用硫酸钠干燥，过滤并将滤液加入到大量冷乙醚中，过滤干燥得白色粉末状固体。
　　 3α-羧基基-ω-马来酰亚胺聚乙二醇(mal-PEG-COOH)的合成
　　 将mal-PEG-OH(Mn=3.6 kDa)真空干燥，加入三氯甲烷，待其溶解后再加入丁二酸酐，70℃搅拌回流反应，减压除掉部分三氯甲烷，沉淀至大量无水乙醚中，过滤收集固体样品，再用少量三氯甲烷溶解样品，沉淀至大量无水乙醚中，过滤干燥得白色粉末状产物。
　　 4 CDI活化的单甲基醚聚乙二醇(mPEG-CDI)的合成
　　 将单甲基醚聚乙二醇(Mn=2kDa)于干燥两口瓶中，真空干燥，冷却后Ar保护下加入THF充分溶解。取CDI于另一干燥两口瓶中，Ar保护下将溶有mPEG-OH的THF溶液缓慢滴加到两口瓶中反应。加入水使过量的CDI失活，用大量无水乙醚沉淀，过滤后干燥得白色粉末状固体。
　　 5聚乙二醇接枝聚乙烯亚胺(mPEG-g-PEI)的合成
　　 称取支化聚乙烯亚胺和上述白色粉末2.4g分别溶于CHCl3，并将溶有白色粉末的CHCl3溶液加入到hy-PEG的CHCl3溶液中，搅拌反应过夜。用大量无水乙醚沉淀3次，干燥得白色粉末状固体。
　　 66nm SPIO的合成
　　 在反应瓶中加入乙酰丙酮铁(2mmol)、1,2-十六烷二醇(10mmol)、油酸(6mmol)、油胺(6mmol)及苯醚(20ml)，在氮气流下搅拌混合均匀。然后混合物升温至200℃并维持2小时。接着继续升温至300℃，回流一个小时。通过在乙醇中沉淀、离心(6000 rpm)等步骤，重复两次。最后离心沉淀物悬浮于正己烷中以备表征。
　　 7负载SPIO的聚乙二醇-聚乙烯亚胺(mPEG-g-PEI-SPIO)的制备
　　 取mPEG-g-PEI和SPIO(6nm)共溶解于CHCl3中，室温下搅拌过夜并用氩气吹干，向其中加入正己烷，震荡并吸出上层清液。将溶剂挥发干，向其中加入双蒸水溶解，在12000r/min离心，上清液用220 nm针头过滤器过滤样品，在4℃下放置备用。
　　 8 SPIO磁性与结构的表征
　　 通过应用JEM-2010HR透射电镜、D/MAX2000粉末X射线衍射仪、MPMSXL-7磁学性质测量系统、Nicolet/Nexus670红外光谱仪，对相关样品进行磁性与结构的检测。
　　 9 SPIO负载率测定
　　 采用原子吸收法测定聚合物颗粒中SPIO的含量。根据已经建立的标准曲线，测定248.3 nm处的吸收，计算出铁含量。用氧化铁的质量除以颗粒的总质量，得到SPIO的负载率。
　　 10电位和粒径测量
　　 利用动态光散射(Dynamic light scattering measurements，DLS) Brookhaven激光散射系统测量纳米粒的粒径和电位，取三次测量值的平均值。
　　 11空白载体材料mPEG-g-PEI-SPIO体外毒性的安全性评价
　　 采用WST-8法，检测负载SPIO前后的载体材料体外细胞毒性影响，评价其安全性。按公式计算细胞存活率：
　　 细胞存活率(％)=(As-Ab)/(Ac-Ab)*100％
　　 结论：
　　 1合成了用于靶向传输SPIO的载体材料mPEG-g-PEI，建立了聚合物纳米胶束载体材料制备的技术平台，它为后续双重靶向纳米胶束及MRI纳米探针的进一步研究提供了平台。
　　 2采用由Sun等人发明的方法所合成的SPIO纳米颗粒粒径可控、分布均匀、具有超顺磁性，可用作制备MRI对比剂。
　　 3疏水性的SPIO纳米颗粒能被高效负载于mPEG-g-PEI聚合物胶束的疏水性内核，且所制备的聚合物胶束具有超顺磁性，有望成为一种新型、特异性MRI分子探针。
　　 4通过聚合物胶束疏水段化学结构、两亲性比例的控制调控胶束的形状、尺寸、SPIO负载量等，以适合细胞转染。
　　 5构建好的磁性纳米材料mPEG-g-PEI-SPIO细胞毒性减低，适合于细胞转染。
　　 第二部分 PSCA抗体靶向纳米MRI显像探针scAbPSCA-PEG-g-PEI-SPIO构建与表征
　　 目的：构建PSCA抗体靶向纳米MRI显像探针scAbPSCA-PEG-g-PEI-SPIO，对构建好的探针进行免疫验证及表征
　　 材料与方法：
　　 1 PSCA抗体靶向纳米MRI显像探针scAbPSCA-PEG-g-PEI-SPIO构建
　　 将购买的单克隆抗体AbPSCA，用巯基乙胺打开双链成单链抗体片段，露出巯基，与mPEG-g-PEI-SPIO结合，构建AbPSCA靶向纳米MRI显像探针scAbPSCA-PEG-g-PEI-SPIO。
　　 2免疫荧光验证AbPSCA与mPEG-g-PEI-SPIO连接成功
　　 利用荧光二抗对构建好的AbPSCA靶向纳米MRI显像探针scAbPSCA-PEG-g-PEI-SPIO进行染色，通过离心分离法分离蛋白成分和含铁的纳米颗粒，观察纳米颗粒的免疫荧光情况。
　　 3纳米探针scAbPSCA-PEG-g-PEI-SPIO的电位与粒径测定
　　 利用动态光散射(Dynamic light scattering measurements，DLS)Brookhaven激光散射系统测量纳米粒的粒径和电位，取三次测量值的平均值。
　　 结论：
　　 1成功构建好单克隆单链抗体靶向的mPEG-g-PEI-SPIO纳米探针scAbPSCA-PEG-g-PEI-SPIO。
　　 2粒径与电位适合细胞的转染。
　　 3利用纳米制备技术制备了scAbPSCA-PEG-g-PEI-SPIO具有纳米尺寸，并将抗体作为配体高效负载于聚合物胶束的亲水性外壳，使该聚合物胶束获得肿瘤的双重靶向效应，后续的体外实验将对其进行进一步验证。
　　 第三部分 PSCA抗体靶向纳米MRI显像探针scAbPSCA-PEG-g-PEI-SPIO早期诊断PCa体外细胞实验研究
　　 目的：验证PSCA抗体靶向纳米显像探针scAbPSCA-PEG-g-PEI-SPIO对PCa细胞的靶向性和MRI信号变化。
　　 材料与方法：
　　 1 PCa细胞对非抗体靶向和PSCA抗体靶向纳米显像探针铁吸收的普鲁氏蓝染色研究
　　 (1)将含不同Fe浓度的非抗体靶向聚合物纳米颗粒mPEG-g-PEI-SPIO与PC3M细胞在无血清DMEM培养基中共孵育2h后，利用普鲁士蓝染色原理，通过蓝色的变化观察各种SPIO浓度下PC3M细胞吸收铁的变化情况，以检测细胞对纳米颗粒的非主动靶向吸收，并筛选出一个适合的浓度进行抗体靶向研究。
　　 (2)将一个适合的含相同Fe浓度的抗体靶向聚合物纳米颗粒scAbPSCA-PEG-g-PEI-SPIO、非抗体靶向聚合物纳米颗粒mPEG-g-PEI-SPIO与PC3M细胞在无血清DMEM培养基中共孵育2h后，利用普鲁士蓝染色观察PC3M细胞内含铁的情况，检测和比较PC3M细胞对纳米颗粒的吸收情况。
　　 2激光共聚集显微镜(CLSM)观察PC3M细胞吸收scAbPSCA-PEG-g-PEI-SPIO
　　 将不同的聚合物以铁浓度40μg/mL或抗体量相同的条件下与相应的细胞在恒温箱37℃孵育2小时，进行免疫荧光处理后，用CLSM观察。
　　 3纳米探针scAbPSCA-PEG-g-PEI-SPIO体外细胞MRI显像研究
　　 通过体外MRI成像，利用SPIO的T2负性增强效应，反映细胞内含Fe的情况，间接反映PC3M细胞对磁性纳米颗粒的吸收情况。MRI检测PC3M细胞吸收PSCA抗体靶向纳米显像探针scAbPSCA-PEG-g-PEI-SPIO，测量T2WI上MRI信号强度，观察信号强度变化情况，探索利用临床型MRI评价PSCA抗体靶向纳米显像探针对PC3M细胞的靶向效应。
　　 结论：scAbPSCA-PEG-g-PEI-SPIO作为PCa抗体靶向纳米探针，能有效地进入靶细胞，明显提高转染率。scAbPSCA-PEG-g-PEI-SPIO明显改善PCa细胞的MRI的T2信号，为寻找有效的PCa早期诊断方法提供了理论基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写对照表

声明

前 言

第一部分 相关纳米材料的合成及其理化性质表征

1.1 材料与方法

1.2 结果

1.3 讨论

1.4 结论

第二部分 PSCA抗体靶向纳米MRI显像探针scAbPSCA-PEG-g-EI-SPIO构建与表征

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 结论

第三部分 抗体靶向scAbPSCA-PEG-g-PEI-SPIO作为磁性纳米探针在PCa细胞的体外诊断实验研究

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 结论

结束语

参考文献

附录：在学期间发表的论文及参与的科研学术活动

致谢