相关基因多态性与甲氨蝶呤治疗风湿性疾病疗效及不良反应的相关性研究

摘要

目的：①研究中国风湿性疾病患者群中MDR1C3435T、RFC1 G80A、GGH C—401T、FPGS(rs1544105)G>A、MTHFR C677T和MTHFR A1298C基因型的分布，并与其他种族进行比较，明确种族差异。②建立LC/MS/MS分析法测定人血红细胞中甲氨蝶呤谷氨酸聚合物浓度。③分析红细胞内MTXPGs浓度和MTX治疗风湿性疾病疗效、不良反应间的相关性，探讨MTX转运代谢作用通路上的MDR1C3435T、RFC1 G80A、GGH C—401T、FPGS(rs1544105)G>A、MTHFR C677T和MTHFR A1298C基因多态性对红细胞内MTXPGs浓度和对MTX治疗风湿性疾病疗效及不良反应的影响。 方法：⑴用PCR—RFLP的方法检测分析MDR13435、RFC180、GGH—401、FPGS(rs1544105)、MTHFR677和MTHFR1298五个基因6个位点在中国风湿患者群中的分布情况，并验证是否符合Hardy—Weinberg平衡，同时和其他种族基因突变频率与等位基因频率的分布进行比较。⑵采用液质联用电喷雾检测法(LC/MS/MS)。全血经VitaminC37℃孵育3h得到甲氨蝶呤总浓度，不经Vitamin C孵育处理的即为原型甲氨蝶呤浓度，全血甲氨蝶呤谷氨酸聚合物浓度=总甲氨蝶呤浓度—原型甲氨蝶呤浓度。再根据体积比换算为红细胞内甲氨蝶呤谷氨酸聚合物的浓度。提取方法用液液萃取的方法，先用三氟乙酸蛋白沉淀，再用乙酸乙酯提取。样品经电喷雾离子源正离子化后，通过三重四级杆串联质谱仪，采用多反应监测(MRM)对甲氨蝶呤(m/z455.2→308.2)和内标多索茶碱(m/z267.2→181.2)进行测定。色谱柱为Ultimate XB—C18柱，流动相为乙腈(1％甲酸)/甲酸铵水溶液(20 mM)＝30:70，流速为0.2mL/min，柱温为25℃，每个样品的分析时间为3min。⑶用PCR—RFLP法检测MDR1、RFC1、GGH、FPGS和MTHFR基因多态性，用LC/MS/MS法检测红细胞内MTXPGs浓度，用Phase2.1软件分析MTHFR单倍型。用x2检验、非参数检验、多重线性回归、Logistic回归等分析方法分析各个评价指标间的相关性。 结果：①6个位点等位基因频率如下：MDR13435C64％，MDR13435T36％；RFC180G51％,RFC180A49％；GGH—401C81％,GGH—401T19％；FPGS(rs1544105)G26％, FPGS(rs1544105)A74％；MTHFR677C73％, MTHFR677T27％；MTHFR1298A79％，MTHFR1298C21％。各个基因型都符合Hardy—Weinberg平衡。②MTX血药浓度在1～100 ng/mL范围内线性关系良好(r2均大于0.99)，分析方法的最低检测限为0.5 ng/mL。其高、中、低(50、10、2 ng/mL)3种浓度在全血及孵育全血中的平均提取回收率在26.2％～37.8％之间，方法回收率在99.1％-108.4％之间。日内(n=5)、日间(n=3)精密度RSD均<15％。各项稳定性考察符合FDA的有关要求。③红细胞内MTXPGs浓度和RA患者疗效存在相关性，浓度大于25 nmol/L患者疗效较好。④RFC180和GGH—401位突变对胞内MTXPGs浓度的影响有统计学意义，RFC180纯合型和GGH—401野生型个体胞内MTXPGs水平较高。⑤RA患者：单因素分析MTX疗程对VASb、HAQb和TJCb都有显著影响，用药持续时间越长，疗效越好。MDR1、GGH分别与VASb和TJCb有相关性，携带MDR13435纯合型个体疗效较好，GGH—401野生型个体疗效好。MDR13435纯合型分布在疗效好组明显比疗效差组多。经多重线性回归和Logistic回归分析，再次验证用药持续时间、RFC1、GGH对疗效各个评价指标有贡献，影响大小不一。⑥ AS患者：单因素分析只得到年龄对疗效有影响，年龄越大，疗效越差；MDR13435纯合型在疗效好组分布频率高。经多重线性回归分析，也只有年龄和MDR1基因型对疗效的差异有贡献。经Logistic回归分析，MTHFR1298纯合型个体疗效较好。⑦对不良反应的分析发现，MTHFR C677T与不良反应的相关有统计学意义，突变型在不良反应组分布频率较高，提示MTHFR677突变型可能是不良反应的危险因素。携带677T-1298A单倍型个体更容易发生不良反应。 结论：⑴除了MTHFR677的突变频率较低外，本研究风湿患者群中的各基因频率与已报道的北京健康志愿者基因频率相似。各基因频率与其他种族间存在种族差异。⑵本方法简单、快速、灵敏、准确、重现性好，可用于MTX的临床血药浓度监测、药动学研究。⑶红细胞内MTXPGs浓度和RA患者疗效存在相关性，浓度大于25 nmol/L患者疗效较好。RFC180G>A及GGH—401C>T对胞内MTXPGs浓度、RA患者疗效的影响有统计学差异，RFC180纯合型个体和GGH—401野生型个体胞内MTXPGs水平较高，疗效较好。MDR13435纯合型个体疗效较好。RFC180、MDR13435野生型或GGH—401突变型个体在治疗早期可以加用或改用其他更有效的药物，如依那西普、环孢素、环磷酰胺等。MTHFR677突变型个体及携带677T-1298A单倍型个体更容易发生不良反应，对这些患者的治疗可适当降低剂量，并密切注意患者的不良反应。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要英文缩略词

声明

绪论

第一部分 风湿病患者MDR1、RFC1、GGH、FPGS和MTHFR基因型研究

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

附图及表格

第二部分 建立测定红细胞内甲氨蝶呤谷氨酸聚合物浓度的LC/MS/MS方法

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

附图及表格

第三部分 相关基因多态性与甲氨蝶呤治疗风湿性疾病疗效及不良反应的相关性研究

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

附图及表格

第四部分 总结

创新与展望

研究生期间完成的学术成果

参考文献

致谢