阻断Hedgehog信号通路对胰腺癌干细胞自我更新的调节作用

摘要

胰腺癌是一种常见的恶性肿瘤，发病率呈不断上升的越势，占消化道恶性肿瘤的8％～10％。由于缺乏早期的临床表现，多数患者在确诊时已属晚期，只有约12％～15％可进行根治手术，但术后容易复发，预后甚差。传统的化疗药物仅针对癌细胞进行治疗，实验证明，胰腺癌中存在一群数量极少的肿瘤干细胞，其具有自我更新、多向分化及无限增殖的特性；肿瘤干细胞自我更新的概念是肿瘤干细胞指在增殖过程中，通过不均一分裂，一个CSC(cancer stem cell)可分裂成一个新的CSC和另一个可最终分化为包括肿瘤细胞在内的各种细胞的子细胞，使肿瘤能够维持CSC数目稳定并能不断产生肿瘤细胞；胰癌干细胞通过自我更新，不断产生肿瘤细胞，令肿瘤的治疗不能将癌细胞彻底杀灭，是导致肿瘤治疗效果差、易复发及预后差的主要原因。 Hedgehog(HH)信号通路是肿瘤干细胞的自我更新机制之一，主要由四部分所组成，包括：HH配体、2个跨膜蛋白质受体(PTCH)、(Smo)组成的受体复合物以及下游的转录因子Gli蛋白，通过激活此通路使肿瘤干细胞的自我更新能力增强；cyclopamine(环巴明)是Hedgehog信号通路的抑制剂，通过作用于Smo蛋白阻止该信号往下传递，从而抑制肿瘤干细胞的自我更新。目前国内外的研究已证实Hedgehog通路在多种肿瘤中有表达，Hedgehog通路的研究可以为日后针对肿瘤干细胞治疗提供更进一步的资料。 肿瘤干细胞自我更新的机制目前认为有以下五点：①Hedgehog信号通路；②Wnt信号途径；③polycomb group基因家族；④CSC的微环境；⑤成纤维生长因子信号。不同种类的或者类型相同的肿瘤在不同的发展阶段中，肿瘤干细胞存在自我更新的信号表达可能有差异，而且，各机制之间也可能存在相互影响。 为了进一步了解胰腺癌干细胞自我更新的特性，在国内外研究的基础上，我们推测胰腺癌干细胞可能存在Hedgehog信号通路，且参与其自我更新的作用，通过cyclopamine阻断该通路，从细胞增殖、周期及凋亡等方面分析其作用机制，为今后针对胰腺癌干细胞治疗的研究作初步探讨。 研究目的： 选择cyclopamine特异性阻断Hedgehog信号通路，观察其对胰腺癌干细胞自我更新能力的影响作用及其机制，探讨阻断Hedgehog信号通路对胰腺癌的可能治疗作用。 材料和方法： 实验材料： 细胞系胰腺癌PANC-1细胞由中山大学附属第二医院消化内科实验室提供；永生化胰腺导管上皮细胞H6C7细胞由加拿大安大略癌症研究所惠赠。胰腺癌PANC-1细胞培养在RPMI1640(含10％胎牛血清)。H6C7细胞培养在K—SFM培养基中。 实验方法： 1.胰腺癌干细胞的获得方法：将PANC-1球囊细胞培养方法到第12-15天；PANC-1细胞及H6C7细胞培养至对数生长期时进行实验； 2.cyclopamine对胰腺癌干细胞自我更新能力的影响作用：WST—8法检测cyclopamine在不同浓度(0，0.5，1，2，5，10umol/L)及不同时间(24，48，72h)对细胞自我更新的抑制情况； 3.细胞周期和凋亡检测采用流式细胞技术，根据WST—8法检测结果选取cyclopamine10 umol/L浓度及72h分别处理上述三种细胞，利用流式细胞术检测加药前后细胞周期及凋亡的变化。 统计方法： 数据以均数±标准差表示，两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析。应用SPSS11.0 for windows统计软件进行统计学处理。显着性差异水平为P<0.05。 结果： 1.采用悬浮法培养获得胰腺癌干细胞，传代。 2.胰腺癌PANC-1球囊细胞经5、10umol/L浓度的cyclopamine处理72h后细胞随着浓度的提高抑制率呈逐渐上升的趋势，经统计学处理后5及10umol/L的浓度具有统计学意义，其抑制率分别为(31.66±5.30)％、(37.85±13.69)％。而24h及48h未见明显抑制。 3.cyclopamine对胰胰腺癌PANC-1细胞无明显抑制作用，而对永生化胰腺导管上皮细胞H6C7于10umol/L的浓度处理72h后对细胞增殖有明显抑制作用，其抑制率为(43.55±28.98)％，具有统计学意义。而24h及48h未见明显抑制。 4.选取10umol/L浓度的cyclopamine分处理实验细胞72h后进行细胞周期检测；胰腺癌PANC-1球囊细胞及胰腺癌PANC-1细胞出现G1期下降，分别占(36.53±6.03)％及(53.13±1.10)％，而对照组G1期分别占(67.41±6.35)％及(67.64±6.88)％，具有统计学意义。永生化胰腺导管上皮细胞H6C7则未见明显变化(P>0.05)。 5.选取10umol/L浓度的cyclopamine分处理实验细胞72h后进行细胞凋亡检测；结果显示，三种实验细胞于加药前后凋亡细胞数均未见明显变化(P>0.05)。 结论： 1.胰腺癌PANC-1球囊细胞可能存在Hedgehog信号通路，且与其自我更新密切相关； 2.永生化的胰腺导管上皮细胞H6C7可能存在Hedgehog通路的表达； 3.cyclopamine对胰腺癌PANC-1球囊细胞及永生化胰腺导管上皮细胞H6C7的作用并非通过影响细胞凋亡而实现的； 4.阻断Hedgehog信号通路可能成为胰腺癌干细胞靶向治疗的方法。

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材料与方法

实验材料

实验方法

统计学方法

结 果

讨论

结论

参考文献

附 图

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