GRP78在原发性开角型青光眼患者小梁细胞中表达下调的研究

摘要

目的：
　　 本研究通过体外培养人眼小梁细胞，将衣霉素(Tunicamycin)、十字孢碱(Staurosporine)分别作为内质网应激及细胞凋亡处理因素，分子生物学方法检测内质网应激反应伴侣蛋白GRP78在体外培养的正常人及原发性开角型青光眼(POAG)病人眼小梁细胞内mRNA及蛋白表达水平的变化。旨在从新的角度解释GRP78在细胞凋亡中可能发挥的作用，以及因凋亡导致的小梁细胞数目减少进而影响房水流出阻力的调节机制，为POAG的发病机理的研究提供新的思路，为探讨其治疗措施提供新的方向。
　　 方法：
　　 1.人眼小梁细胞的体外培养和鉴定：
　　 1)组织块培养法培养正常人小梁细胞(NTM)及POAG患者小梁细胞(GTM)
　　 2)显微镜观察、免疫细胞化学等方法鉴定人眼小梁细胞；
　　 2.药物处理小梁细胞：
　　 1)将细胞分为空白组、对照组和处理组，处理组细胞培养液分别添加Tunicamycin(Tm)、Staurosporine(STS)、对照组添加dimethylsulfoxide(DMSO)进行细胞培养观察内质网伴侣蛋白GRP78表达的改变；
　　 2)应用MTS法检测Tm、STS对人眼小梁细胞的毒性；
　　 3.检测人眼小梁细胞内GRP78表达的差异：
　　 1)应用Real-timePCR检测人小梁细胞GRP78mRNA的表达；
　　 2)应用Western blot方法检测人小梁细胞GRP78蛋白的表达；
　　 3)应用细胞免疫化学染色法通过共聚焦显微镜观察GRP78蛋白与Myocilin蛋白的共定位情况。
　　 结果：
　　 1.小梁网细胞鉴定：
　　 原代正常人和POAG患者小梁网细胞均表达FN、LN、NSE、vimentin；第Ⅷ因子阴性。
　　 2.药物处理对小梁细胞的影响：
　　 1)形态观察：光镜下可见POAG患者与正常人，小梁细胞形态、分布上未见明显差别；用Tm、STS药物处理后，小梁细胞胞突减少，细胞体积缩小，密度下降，STS处理组较TM组变化明显，DMSO处理组小梁细胞形态无明显变化。
　　 2)MTS法检测(细胞增殖检测)：1μM，1μM，10μM，30μM，100μMTm或0.03μM，0.1μM，0.3μM，0.9μM，1.2μMSTS培养细胞24小时后，NTM与GTM增殖均受抑制，GTM受抑制更为明显，差别具有统计学意义，P＜0.05；
　　 3.人眼小梁细胞内GRP78表达的差异：Real-timePCR和Western blot显示相似的结果：
　　 1)原代POAG患者小梁网细胞内GRP78水平明显低于正常人，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 2)Tm可增加正常人及POAG患者小梁细胞内GRP78的表达水平，但后者的增高水平明显低于前者，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 3)Tm对人小梁细胞内GRP78表达水平的影响明显大于STS，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 4)GTM细胞对凋亡诱导剂STS的反应大于NTM细胞。
　　 4.共聚焦显微镜观察显示
　　 1)POAG患者小梁细胞及Tm、STS处理过的正常人小梁细胞内GRP78蛋白与Myocilin蛋白共定位，而未处理的正常人小梁细胞内GRP78蛋白与Myocilin蛋白分布有差异；
　　 2)POAG患者小梁细胞及用Tm处理过的正常人小梁细胞内GRP78出现核周聚集现象，而在正常人小梁细胞及STS处理过的小梁细胞内则无此现象
　　 结论：
　　 1.POAG患者小梁细胞对内质网应激的反应能力下降，GRP78表达受抑制，导致小梁细胞对损伤性刺激的敏感性增强；
　　 2.POAG患者小梁细胞GRP78可能与Myocilin蛋白存在相互作用，共同导致小梁细胞凋亡。
　　 3.POAG患者小梁细胞中GRP78表达下调，提示GRP78可能在内质网应激诱导产生的小梁细胞凋亡中起保护作用；

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词表

声明

前 言

材料与方法

1.实验材料

2.实验方法

实验结果

1.人眼小梁细胞的体外培养与鉴定结果

1.1 体外培养人眼小梁细胞的形态特征

1.2 体外培养人眼小梁细胞的免疫细胞化学鉴定

2.人眼小梁细胞GRP78表达差异

2.1 光镜下小梁细胞形态观察

2.2 MTS检测TM、STS对人眼小梁细胞生存率的影响

2.3 Real-time RT-PCR方法检测GRP78在人眼小梁细胞mRNA水平的表达

2.4.Western blot方法检测GRP78在人眼小梁细胞蛋白水平的表达

2.5 免疫荧光细胞化学检测GRP78和Myocilin在人眼小梁细胞的表达分布

讨 论

结论

问题与展望

参考文献

附录

致谢