急、慢性吗啡处理对大鼠大脑皮质tau蛋白磷酸化水平的影响及其机制探讨

摘要

阿片类药物作为一种较强的镇痛剂常用于治疗急性和慢性疼痛，但长期应用阿片类药物所致的神经损害明显阻碍了其临床应用。目前，阿片类药物导致神经损害的细胞和分子机制尚不明确，了解其机制对于降低阿片类药物的副作用及更广泛地应用这类药物具有相当重要的意义。
　　 Tau蛋白是微管相关蛋白家族的成员之一，在神经系统的发育和维持微管功能等方面具有重要作用，多种神经系统退行性疾病中都出现了与tau蛋白相关的特征性病理改变。tau蛋白过度磷酸化可影响其正常功能，引起一系列的病理损害。tau蛋白过度磷酸化后，其促微管聚合功能丧失，神经元微管解体，易于聚集成双螺旋丝(paired helical filaments，PHF)以及形成神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle，NFT)结构，并转变成为毒性分子，可结合神经元中正常的微管相关蛋白，使微管结构崩解，神经元退变。
　　 多种蛋白激酶系统参与了tau蛋白的磷酸化过程，其中PI3K/Akt/GSK-3β以及CDK5信号通路是近年来研究tau蛋白磷酸化过程中涉及较多的两个信号通路。此外，近年的研究显示GSK-3β和CDK-5在介导吗啡依赖和耐受的过程中具有重要的作用。
　　 目的：
　　 从在体水平研究吗啡对神经元tau蛋白磷酸化水平的影响，并且从细胞信号转导的角度探讨这个过程中的分子机制，从而为进一步阐明吗啡神经毒性的机制以及提出有效的吗啡神经毒性预防措施提供新的思路和理论依据。
　　 材料与方法：
　　 1、雄性SD大鼠40只，随机分为急性对照组，急性吗啡处理组，慢性对照组，慢性吗啡处理组；急性吗啡处理组腹腔注射吗啡30mg/kg1次，慢性吗啡处理组腹腔注射吗啡10mg/kg，每天2次(8：00，20：00)共20天，急性和慢性对照组以相同方式注射等量的生理盐水。采用免疫印迹法测定在末次注射后第1d、3d、7d大鼠前额皮质tau蛋白上Ser396/404的磷酸化水平变化。
　　 2、雄性SD大鼠20只，分为对照组和急性吗啡处理组，急性吗啡处理组腹腔注射吗啡30mg/kg1次，对照组以相同方式注射等量的生理盐水。采用免疫印迹法测定在末次注射后第1d、3d、7d大鼠前额皮质GSK-3β、CDK5及其亚基P35表达水平变化，免疫放射法测定GSK-3β和CDK5活性变化。
　　 3、雄性SD大鼠30只，分为对照组、吗啡注射对照组(Vehicle组)、CDK5拮抗组(Roscovitine组)、GSK-3β拮抗组(Licl组)、CDK5+GSK-3β拮抗组(Roscovitine+Licl组)。CDK5拮抗组在吗啡注射前30min脑室注射roscovitine90nmol/4μl；GSK-3β拮抗组在接受吗啡注射前7天开始腹腔注射Licl63mg/kg，每天两次；CDK5+GSK-3β拮抗组接受以上两种处理；吗啡注射对照组在吗啡注射前30min脑室注射用于溶解Roscovitine的溶解液4μl。除对照组外，所有大鼠在处死前24h腹腔注射吗啡30mg/kg1次，对照组以相同的方式注射等量的生理盐水。所有大鼠在接受吗啡或生理盐水注射24小时后被断头处死，免疫印迹技术检测大鼠前额皮质tau蛋白磷酸化水平。
　　 结果：
　　 1.急、慢吗啡处理诱导前额叶皮质tau蛋白磷酸化水平的增高急性吗啡处理引起大鼠前额皮质tau蛋白在位点Ser396/Ser404上磷酸化水平短暂升高，急性吗啡处理处理后第一天tau蛋白磷酸化水平显著升高，第三天则恢复正常。慢性吗啡处理后第一天、第三天和第七天tau蛋白在位点Ser396/Ser404上的磷酸化水平均显著升高。
　　 2.CDK5和GSK-3β信号通路在急性吗啡处理诱导大鼠前额皮质tau蛋白磷酸化水平升高中的作用急性吗啡处理后第一天和第三天CDK5表达增加，CDK5活性升高，第七天恢复正常；CDK5的调节亚基P35表达无明显变化；急性吗啡处理后第一天GSK-3β表达增加活性升高，第三天和第七天与对照比较无明显差别。抑制CDK5和GSK-3β信号通路的激活均能够抑制急性吗啡处理所诱导的tau蛋白磷酸化。
　　 结论：
　　 1.急性吗啡处理可引起大鼠前额皮质tau蛋白磷酸化水平短暂升高；慢性吗啡处理可引起大鼠前额皮质tau蛋白磷酸化水平持续升高。
　　 2.急性吗啡处理可能通过上调CDK5和GSK-3β的活性导致tau蛋白过度磷酸化。
　　 综上所述，我们的研究初步阐明了急、慢性吗啡处理对tau蛋白磷酸化水平的影响并初步探讨了相关的分子机制，结果将为进一步阐明吗啡神经毒性的分子机制以及探寻有效的预防措施提供新的思路和理论依据。

目录

文摘

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论文说明：英文缩略语表

声明

前言

研究背景

第一部分急、慢性吗啡处理对大鼠前额皮质tau蛋白磷酸化水平的影响

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

1.4结论

第二部分急性吗啡处理导致大鼠大脑皮质tau过度磷酸化的机制的探讨

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

2.4结论

参考文献

本研究的局限性和进一步研究方向

致谢

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