Sorafenib通过下调pERK活性增加Daunorubicin对白血病K562和U937细胞的抑制作用

摘要

研究背景：
　　 白血病是一组异质性恶性克隆性疾病，系造血干细胞或祖细胞突变引起的造血系统恶性肿瘤，约占恶性肿瘤总发病率的5％左右，是儿童和青少年中最常见的一种恶性肿瘤。已知白血病发病机制中起主要作用的因素包括造血调控转录因子异常所引起的分化障碍及造血生长因子受体如受体酪氨酸激酶等异常引起的增殖过度，这两方面的突变合并作用形成的“二次打击”已成为白血病的主要发病机制。
　　 目前白血病的传统治疗方法仍然是以蒽环类抗生素(如：柔红霉素，daunorubicin，DNR)为主的联合化疗方案，但因白血病细胞遗传学及分子生物学的不同，不同白血病细胞对化疗的敏感性不同，存在原发性耐药和继发性耐药。已有人证明活化的Raf/MEK/ERK通路能够通过磷酸化激活核转录因子，激活MDR(multidurg resistance1，MDR)基因启动子，上调P-gp的表达，诱导耐药。因此寻找一种能通过抑制Raf/MEK/ERK通路活性增加传统化疗药物活性的药物，将有可能延缓白血病细胞的耐药并增加化疗的缓解率。
　　 索拉非尼(Sorafenib)是一种口服的Raf激酶(丝裂原活化蛋白激酶mitogenactivated protein kinase信号传递的关键调节者)抑制剂，已经被FDA批准用于肝癌和肾癌的治疗，能够通过抑制Raf/MEK/ERK(丝裂原活化蛋白激酶通路mitogen-activated protein kinase/ERK kinase/ERK extracellular signal-regulatedkinase pathway)通路抑制肿瘤细胞增殖和血管形成，发挥抗肿瘤的作用。本研究探讨Sorafenib联合DNR作用于人白血病K562和U937细胞株的抑制作用，验证两药联合能否够产生协同抗白血病细胞的作用，并初步阐述产生协同作用的可能的分子学机制。
　　 研究目的：
　　 1，Sorafenib联合DNR是否能够产生协同抗白血病细胞的作用；
　　 2，Sorafenib联合DNR产生协同作用可能的分子机制。
　　 材料和方法：
　　 MTT法(细胞毒性实验)测定Sorafenib和DNR单独作用于K562和U937细胞的抑制率(IC50，IC10)及DNR IC10联合不同浓度Sorafenib作用于K562及U937的联合抑制率；流式细胞Annexin V/PI法测定单药及联合用药后K562细胞的凋亡率以及Hoechst33258染色法观察单药及联合作用后细胞凋亡形态的改变；Western Blot法测定Sorafenib、DNR及U0126对K562及U937 p-ERK1/2的影响；根据金氏方程证明两种药物联合抑制率及凋亡是否有协同作用。
　　 结果：
　　 1.索拉非尼、柔红霉素单药及联合对K562及U937的抑制率
　　 MTT结果示DNR、Sorafenib单药抑制K562和U937生长呈浓度依赖性。柔红霉素对K562的IC10为0.82±0.12ug/ml，U937的IC10为0.055±0.011ug/ml，由结果可知DNR对U937的敏感性明显高于K562(P＜0.001)。以不同浓度的Sorafenib(4.0-16.0ug/ml)联合DNR对K562及U937的IC10，测定两药之间的联合作用效果。Sorafenib联合DNR对K562和U937的抑制作用明显高于单药处理组，且不同药物浓度组的q值均大于1.15(p＜0.01)，提示两药联合对K562、U937均能产生协同抑制的作用。
　　 2.索拉非尼联合柔红霉素能够产生协同诱导K562细胞凋亡
　　 以DNR(1.0ug/ml)、不同浓度Sorafenib(4.0-16.0ug/ml)单药及联合作用于K562细胞48小时后，通过Annexin V-FITC/PI法测定单药及联合后K562的凋亡率。结果示：Sorafenib联合DNR能够产生协同诱导K562凋亡的作用(q＞1.15，p＜0.01)，且随着Sorafenib浓度的增加凋亡的细胞也增加。为进一步证实流式细胞仪检测凋亡率的结果，以Hoechst33258 DNA染色法观察柔红霉素(1.0ug/ml)、索拉非尼(12.0ug/ml)单药及联合作用于K562细胞48小时后，凋亡形态学的改变，结果可见联合作用组被Hoechst33258染色细胞明显高于单药组及对照组。两者之间有较好的一致性。
　　 3.Sorafenib、DNR对K562细胞pERK1/2水平的改变
　　 Sorafenib能够下调K562细胞pERK1/2水平呈浓度和时间依赖性，在16.0ug/ml浓度下作用24小时后，能完全抑制pERK1/2水平。DNR在浓度1.0ug/ml的条件下，30分钟内能够逐渐增加pERK1/2水平，但Sorafenib联合DNR仍然能够抑制pERK1/2的表达，与单药作用后的效果相似(P＞0.05)。
　　 4.上调K562 pERK2水平能够降低DNR抗K562的抑制作用
　　 用EGFP-N3空载体和携带有MEK2DD质粒的载体转染K562细胞，转染不同质粒的K562细胞增值率无明显差异；加入不同浓度DNR作用于K562-EGFP-N3和K562-EGFP-N3-MEK2DD细胞48小时后，后者DNR IC50比前者明显增加，(3.33±0.2ug/ml)大于(1.71±0.14ug/ml)(P＜0.01)。
　　 5.小分子MEK抑制剂(U0126)能够通过下调pERK1/2水平增加柔红霉素对K562的抑制作用
　　 小分子MEK抑制剂U0126(20umol/l)联合DNR(0.25-8.0ug/ml)作用于K562细胞48小时后，结果：DNR联合U0126能产生协同抑制K562细胞的作用，各个浓度的q值均大于1.15(P＜0.01)。加入U0126后能够明显降低DNR对K562细胞的IC50，下调pERK1/2水平能够增加DNR对K562的抑制作用。
　　 结论：
　　 1，Sorafenib联合DNR作用于白血病细胞K562、U937存在协同抑制及凋亡诱导作用；
　　 2，DNR对U937的抑制作用明显高于K562；Sorafenib对K562的敏感性高于U937细胞，可能与两种细胞pERK1/2水平的不同相关；
　　 3，上调K562细胞pERK1/2表达能够减弱DNR对它的抑制作用；
　　 4，Sorafenib可能通过下调p-ERK1/2水平增加DNR抗白血病细胞K562和U937的效应。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

第二章实验材料

第三章实验方法

第四章实验结果

第五章讨论

第六章结论

参考文献

附录1：英文缩写和中英文对照

附录2：综述 多靶点抗肿瘤药索拉非尼治疗急性白血病的进展

致谢