腰带长体茧蜂多胚发育及整合素β亚基在其胚胎增殖中的功能研究

摘要

多胚发育是一种独特的发育模式，一个卵可以分裂产生许多遗传上相同的胚胎。目前关于多胚发育的研究大多集中在膜翅目昆虫—跳小蜂科的佛州点缘跳小蜂(Copidosoma tloridanum)上。然而，只对这一种物种进行多胚发育研究，很难发现这种奇特的发育方式中保守的发育机制，也很难研究它在进化上是如何出现的。因此我们研究了膜翅目茧蜂科内另一种多胚发育的昆虫——腰带长体茧蜂(Macrocentrus cingulum)的发育过程。此外，在分子水平上对多胚发育中胚胎的增殖机制做了一些初步探究，目前国内外对这方面的研究还不深入。
　　 腰带长体茧蜂是一种多胚发育的幼虫内寄生蜂，通常寄生一个或几个卵到寄主——亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)幼虫体内，最终它的一个卵可以产生几十头蜂。本文主要通过解剖寄主幼虫观察茧蜂的胚胎，并结合胚胎培养和胚胎移植研究了M.cinglulum的多胚发育过程，另外也通过扫描电镜观察了一些胚胎的细致特征。研究发现，腰带长体茧蜂胚胎的发育主要分为卵裂期、胚胎增殖期和形态发生期。茧蜂的卵细胞进入寄主体内首先发生卵裂，接着卵细胞被分离为多个初级胚胎细胞，它们单独发育为多个二级桑葚胚。二级桑葚胚又分裂为多个二级胚胎细胞，每个二级胚胎细胞随后可以进入形态发生阶段从而形成蜂的幼虫。通过胚胎移植实验发现，二级胚胎细胞具有极强的增殖能力，它可以分化进入形态发生阶段，也还可以重新形成二级桑葚胚。从发育过程来看，二级桑葚胚分裂为多个二级胚胎细胞，并且它们每一个可以最终发育为—头蜂幼虫，这是形成多胚发育的一个重要原因。通过与跳小蜂多胚发育模式的比较，我们发现它们早期胚胎发育都经过大量胚胎的隔离，因此我们推测胚胎隔离是造成多胚发育产生的主要原因。
　　 整合素是一类跨膜蛋白，它是由α和β亚基组成的异二聚体。整合素的功能非常广泛，它在调控细胞增殖中起重要作用，其中β亚基的功能更为重要。本文初步研究了整合素β亚基在茧蜂胚胎增殖中所起的作用。采用RACE方法克隆了腰带长体茧蜂中整合素β亚基的全长基因，整合素β亚基基因开放阅读框全长2526bp，编码841个氨基酸；利用荧光定量PCR检测了整合素β在各胚胎发育时期的表达情况，研究发现整合素β亚基mRNA在卵细胞、初级胚胎和二级胚胎中都有转录，在卵细胞中有相对较高的表达，而在初级胚胎和二级胚胎内表达相对较低并且相近；进一步利用RNA干扰的方法研究整合素对茧蜂胚胎增殖的影响，将体外合成整合素β亚基的dsRNA注射到寄生后的玉米螟体内，发现最终出蜂数量相对于对照显著降低，表明整合素在调节多胚发育胚胎增殖过程中起重要的作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 前言

1.1多胚发育研究概况

1.1.1多胚发育研究历史及现状

1.1.2佛州点缘跳小蜂的多胚发育

1.1.3佛州点缘跳小蜂多胚发育与其它发育模式的比较

1.1.4其它昆虫多胚发育研究概况

1.2整合素在细胞增殖过程中的作用

1.2.1整合素的结构特点

1.2.2整合素的激活及信号传导

1.2.3整合素影响细胞增殖的调控方式

1.3 RNAi在昆虫中的应用

1.3.1 dsRNA介导的RNAi的原理

1.3.2昆虫中RNAi的研究方法

1.3.3 dsRNA或siRNA进入细胞的机制

1.4本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

2.1材料

2.1.1实验材料

2.1.2实验耗材

2.2主要试剂和溶液

2.2.1主要试剂

2.2.2主要溶液

2.3实验仪器

2.4实验方法

2.4.1茧蜂卵细胞和胚胎的收集

2.4.2卵细胞及胚胎的培养及观察

2.4.3胚胎移植

2.4.4扫描电镜(SEM)观察胚胎

2.4.5腰带长体茧蜂β-integrin(Mcitg β)的克隆

2.4.6 Real-time检测β-integrin在不同胚胎发育时期的表达

2.4.7 RNAi β-integrin的表达

第三章 结果与分析

3.1腰带长体茧蜂的多胚发育

3.1.1腰带长体茧蜂与亚洲玉米螟的发育历程

3.1.2卵裂产生初级桑葚胚

3.1.3二级桑葚胚形成

3.1.4二级胚胎细胞从二级桑葚胚释放

3.1.5形态发生

3.2β-integrin在胚胎增殖中的作用

3.2.1 β-integrin基因的克隆

3.2.2 β-integrin在不同胚胎发育时期的表达

3.2.3体外浸泡法RNAi的效果检测

3.2.4体内注射法RNAi对茧蜂出蜂数量的影响

第四章 讨论

4.1茧蜂多胚发育中多胚产生的原因

4.2茧蜂与跳小蜂多胚发育模式的异同

4.3多胚发育的产生机制

4.4腰带长体茧蜂RNAi的效果

4.5整合素调控茧蜂胚胎增殖的可能机制

4.6多胚发育的潜在研究模型

第五章 总结与展望

本论文的创新点

参考文献

附录

致谢