人前列腺癌PC-3细胞系中肿瘤干细胞的富集、培养与鉴定的初步研究

摘要

目的:
　　 建立体外悬浮聚球法培养PC-3细胞系的技术规范,从PC-3细胞系中分离、富集、培养前列腺癌干细胞并对PC-3悬浮成球细胞的肿瘤干细胞特性进行鉴定,证明悬浮培养可以从PC-3细胞系中高效、简便地富集前列腺癌干细胞,为进一步的深入研究奠定基础。
　　 方法:
　　 1.采用无血清培养液(serum-free medium,SFM)在体外悬浮细胞聚球法培养PC-3细胞,观察其生长特征。通过连续传代更新、在无血清培养液中滴加血清诱导分化、以及交替在无血清/含血清培养液中培养等方法,观察成球细胞生长方式的转变,鉴定悬浮成球细胞具有无限增殖能力、自我更新能力和多向分化潜能等肿瘤干细胞特性。
　　 2.以常规在含血清培养液中单层贴壁培养的PC-3细胞为对照组,采用流式细胞术检测PC-3悬浮成球细胞中前列腺癌干细胞表型CD44+CD133+细胞比率以及SP(side population)细胞比率,通过顺铂的化疗耐药性分析检测PC-3悬浮成球细胞是否具有化疗抵抗性,采用Real-time PCR方法检测PC-3悬浮成球细胞中肿瘤干细胞特异性标志物CD44、CD133、Oct-4和ABCG2的mRNA表达量,从细胞和基因层面对PC-3悬浮成球细胞具有肿瘤干细胞特性并富集了前列腺癌干细胞进行鉴定。
　　 3.采用Transwell实验分别检测PC-3悬浮成球细胞和PC-3单层贴壁细胞的体外迁移能力,初步探讨前列腺癌干细胞与前列腺癌转移之间的关系。
　　 结果:
　　 1.PC-3悬浮成球细胞(spllere-forming cells)具有强增殖能力,可以直接适应体外无血清培养环境,在无血清培养液中生存并形成悬浮前列腺癌细胞球(prostasphere)。悬浮培养第5天时开始可以观察到典型的悬浮前列腺癌细胞球形成,至培养第10天时悬浮细胞球形成效率可达到2.60％±1.0％,较第5天时明显增多(P<0.05)。此后,悬浮细胞球形成效率在培养第15天时可达到3.3％±1.1％,在培养第20天时最高可达到3.6％±1.2％,其后不再有明显增长。
　　 2.PC-3悬浮成球细胞具有自我更新能力,在体外可以连续、稳定地传代。经过连续2次传代后,每代的细胞形态及细胞球形态均与原代相同,细胞球形成效率也保持稳定,与原代细胞球形成效率无统计学差异(P>0.05)。
　　 3.PC-3悬浮成球细胞具有分化潜能,在无血清培养液中逐日添加血清后,悬浮细胞球可以分化,逐渐变小、贴壁生长并于7天左右时完全分化成为单层贴壁细胞,形态与在含血清培养液中常规培养的PC-3细胞无明显差别。
　　 4.PC-3悬浮成球细胞具有分化能力和微环境依赖性,在环境条件诱导下可以发生分化、增殖,在含血清和无血清两种培养液中其生长方式可以出现交替转换,而且这种转换能力并不会随着传代而减弱。
　　 5.PC-3悬浮成球细胞富含肿瘤干细胞样细胞(cancer stem-like cells),其中前列腺癌干细胞表型CD44+CD133+细胞比率为13.94％,SP细胞比率为3.1％,均显著高于常规培养的PC-3单层贴壁细胞(分别为0.77％和0.0％,P<0.05)。
　　 6.PC-3悬浮成球细胞比PC-3单层贴壁细胞对顺铂具有更强的耐药性,IC50是贴壁细胞的4.26倍(分别为520μmol/L和122μmol/L,P<0.05)。
　　 7.PC-3悬浮成球细胞中肿瘤干细胞标志物CD44、CD133、Oct-4和ABCG2的mRNA表达均明显高于PC-3单层贴壁细胞,其相对表达量分别是单层贴壁细胞的41.83倍、10.48倍、4.08倍和33.98倍,两组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。
　　 8.PC-3悬浮成球细胞及其在形态学上已经完全分化的子代细胞的体外迁移能力均较PC-3单层贴壁细胞明显减弱(P<0.05),但是在PC-3悬浮成球细胞与其子代细胞之间却无明显差异(P>0.05)。
　　 结论:
　　 1.PC-3悬浮成球细胞具有自我更新能力、无限增殖能力、多向分化潜能、化疗耐受性强等肿瘤干细胞特性,高表达肿瘤干细胞标志物并且富含有CD44+CD133+细胞、SP细胞等前列腺癌干细胞样细胞。体外无血清悬浮聚球法培养PC-3细胞系可以初步分离和富集前列腺癌干细胞,并且具有高效、简便、经济且实用性强的优点。
　　 2.PC-3悬浮成球细胞的体外迁移能力较弱,提示前列腺癌干细胞的迁移、侵袭能力较弱,前列腺癌转移可能并非由于肿瘤干细胞主动迁移所致。
　　 3.PC-3悬浮成球细胞在形态学上已经完全分化的子代细胞的体外迁移能力仍然明显弱于贴壁细胞,提示前列腺癌干细胞的分化、增殖等生物学特性复杂,形态上的分化并不能代表或等同于功能学上的分化成熟。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章 悬浮细胞聚球法培养人激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞系富集前列腺癌干细胞

材料与方法

结果

讨论

小结

第二章 人激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞系中前列腺癌干细胞的鉴定

材料与方法

结果

讨论

小结

全文总结

参考文献

英文缩写与注解

攻读学位期间发表的论文

致谢