NT-3基因修饰的MSCs移植促进大鼠脱髓鞘脊髓损伤修复的研究

摘要

本实验旨在研究神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3)基因修饰的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)移植入大鼠脱髓鞘脊髓损伤处，通过移植的MSCs自分泌外源性NT-3，诱导其向少突胶质细胞分化，重建髓鞘结构，修复脱髓鞘脊髓的神经传导功能。这将丰富人们对基因修饰的MSCs移植治疗脱髓鞘脊髓模型动物的实验机制理解，为基因修饰的MSCs移植治疗相关的脱髓鞘疾病提供实验依据。为验证上述研究设想，现将实验内容分以下三部分：
　　 第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养、检测及NT-3基因重组腺病毒的转染和鉴定
　　 目的：用重组腺病毒为载体，体外构建NT-3基因转染的骨髓间充质干细胞(MSCs)，为细胞移植提供稳定的细胞来源。
　　 方法：从幼年雄性SD大鼠股骨中获取全骨髓细胞，通过不断传代使MSCs纯化。NT-3基因重组腺病毒(AdvNT-3)感染纯化的MSCs细胞48h。X-gal和NT-3免疫荧光染色检测NT-3基因重组腺病毒的转染效率。
　　 结果：选取经过转染携带有LacZ基因腺病毒的MSCs培养孔板，用X-gal组织化学染色显示转染率约为30～40％。这表明在NT-3基因重组腺病毒的感染MSCs的转染率可能也有30～40％。免疫荧光组化染色结果显示，在脊髓脱髓鞘区域内移植的NT-3基因转染MSC可持续表达NT-3至少3周。
　　 结论：在体外能够获得较稳定表达NT-3基因转染的MSCs，这为体内细胞移植提供可靠的NT-3基因转染的MSCs。
　　 第二部分EB诱导脊髓脱髓鞘大鼠模型的建立
　　 目的：探讨溴化乙锭(ethidium bromide，EB)注射所致的脱髓鞘脊髓损伤大鼠模型的建立及鉴定。
　　 方法：将25只SD大鼠(雌性，体重：220g～280g)分为2组，其中A组皆行EB造模，B组注射PBS做为对照。2组大鼠经麻醉后，在T9～10胸髓处局部垂直注射1μlEB(1mg/ml)或1μlPBS。3周后进行HE、Luxol Fast Blue(LFB)、APC、GFAP免疫荧光组织化学染色和半薄切片观察、透射电镜观察。
　　 结果：对两组大鼠脊髓组织进行H染色、LFB组织化学染色、APC和GFAP免疫荧光组织化学染色，可见A组脊髓背角脱髓鞘区域的星形胶质细胞和少突胶质细胞大量丢失。光镜半薄切片和电镜超薄切片观察，皆可见脊髓脱髓鞘区域有大量明显溃变的髓鞘。
　　 结论：EB注射能够成功制备大鼠脊髓局部脱髓鞘模型。
　　 第三部分NT-3基因转染的MSCs移植对大鼠脱髓鞘脊髓损伤修复的影响及其机制的探讨
　　 目的：应用NT-3基因重组腺病毒转染的MSCs移植入EB模型大鼠脊髓内，观察这种细胞治疗策略对脱髓鞘损伤后的结构和功能修复的影响，与此同时对其修复机制进行初步探讨。
　　 方法：将上一章已造模大鼠分为：A.AdvNT-3-MSCs组。B.AdvLacZ-MSCs组C.MSCs组。D.EB组。E.PBS组；其中：A、B、C、D组均来自上一章的A组(EB损伤组)；E组来自上一章的B组(PBS组)。5组大鼠皆于术后，每周施行两次独木桥功能评分。并在观察3周(21天)后，行电生理检测及NG2、APC等少突胶质细胞标志物的免疫荧光染色，荧光显微镜下对AdvNT-3-MSCs组、MSC细胞移植组、AdvLacZ-MSCs组大鼠进行细胞计数统计比较阳性细胞数及计算其分化率。光镜半薄切片定量检测新生髓鞘、正常髓鞘及脱髓鞘形态数量及各组髓鞘存活率、电镜超薄切片观察各组髓鞘形态。
　　 结果：独木桥功能测试评分结果显示，AdvNT-3-MSCs组大鼠后肢活动功能恢复成与PBS组一样，没有明显差异；与其余组比较皆有统计学差异(P＜0.05)；电生理测试结果显示，AdvNT-3-MSCs组大鼠脊髓诱发电位峰峰值与PBS组比较，没有明显统计学差异；与EB组以及其它细胞移植组比较，均有明显差异(P＜0.05)。免疫荧光组织化学染色阳性细胞计数结果显示，AdvNT-3-MSCs组的NG2和APC阳性细胞数量多于其余4组，皆有统计学差异(P＜0.05)。半薄切片的髓鞘计数结果显示，AdvNT-3-MSCs组在新生髓鞘数量和复髓鞘比例计数上与所有其它细胞移植组比较，皆有明显增加(P＜0.05)。
　　 结论：移植在大鼠脱髓鞘脊髓内的NT-3基因转染MSCs能够存活，并分化为少突胶质细胞，形成新的髓鞘结构，修复脊髓的功能。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要英文缩写表

声明

第1章 前言

1.脱髓鞘疾病病理生理机制

2.外源性细胞移植在脱髓鞘脊髓损伤疾病治疗中的研究进展

3.脱髓鞘模型的研究现状

4.本研究的目的和意义

第2章 大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养、检测及NT-3基因重组腺病毒的转染和鉴定

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第3章 EB诱导脊髓脱髓鞘大鼠模型的建立

1.实验材料

2.实验方法

3.检测EB诱导脊髓脱髓鞘模型的指标

4.实验结果

5.讨论

第4章 NT-3基因转染的MSCs移植对大鼠脱髓鞘脊髓损伤修复的影响及其机制的探讨

1.实验材料

2.实验方法

3.检测指标的测定

4.统计学方法

5.实验结果

6.讨论

小结

结论

附图及附图说明

参考文献

致谢