2014-2016年我国华南地区PEDV流行病学调查及PEDV SC-14株的分离鉴定

摘要

猪流行性腹泻是当前我国比较流行的猪病之一，它是一种猪群肠道性传染病，临床上可造成各个日龄猪群的呕吐，腹泻，脱水等症状，尤其7日龄哺乳仔猪发病死亡率较高。近几年，世界范围内大多区域均爆发变异PEDV，给全球养猪业造成重大打击。因此，研究该病的流行与变异情况，建立快捷简便的检测方法，摸索病毒繁殖条件，分离病毒显得尤为重要。
　　本实验研究主要针对近两年我国华南四省PEDV的流行情况做PEDV流行病学调查及S基因全基因的遗传变异分析，并建立了PEDV经典毒株与流行毒株快速检测鉴别方法，分离鉴定了PEDV SC-14株，主要研究内容如下：
　　1、PEDV的流行病学调查及S基因的遗传变异分析2014年～2016年三年间，在我国华南地区（广东、广西、福建、江西）四个省份共采集300份的腹泻样品进行相关检测，检测结果发现江西地区阳性率最高达74%，广西地区阳性率最低为45%，四省的PEDV平均阳性率为58%。随机选取其中9份PEDV阳性病料进行PEDV S基因全基因测序，结果基因分析显示：9株均为PEDV流行毒株，这9株流行毒株S基因全基因同源性在98.5%～99.6%，与疫苗毒株相比存在共同的2个区域插入和1个区域缺失片段，且独立于疫苗毒株，形成单独的进化树分支G2组。
　　2、鉴别PEDV经典毒株与变异毒株的巢式RT-PCR方法的建立通过PEDV S基因分析可知当前PEDV流行变异毒株在S基因的58-62aa处有4个氨基酸的插入（即12个碱基的插入），依照这一特点本研究设计了两对特异性内外围扩增引物，经过优化扩增条件，特异性和敏感性系列试验，建立了一套可以快速鉴别PEDV变异毒株与经典毒株的巢式RT-PCR检测法，该检测方法可以快速鉴别PEDV变异毒株和经典毒株，经典毒株仅在外围扩增产物有719bp的条带，内围扩增产物没有条带；变异毒株在外围扩增产物有730bp的条带，内围扩增产物有514bp的条带。实验结果证明该巢式RT-PCR检测方法操作快捷简易、特异性和灵敏度均相对较好，是一种比较高效准确的实验室检测方法。
　　3、PEDV SC-14株的分离、鉴定将检测为PEDV阳性的病料经过滤后在Vero细胞上连续进行盲传，当传至第8代时出现细胞皱缩，变圆等比较典型细胞病变，当在细胞中传至20代时病毒能够稳定增殖，且出现CPE的时间明显缩短。从31代开始，通过在培养体系中设置不同的胰酶终浓度、病毒的吸附时间以及病毒受体PAPN终浓度，将分离的病毒继续繁殖10代，后分别测定不同培养方式下病毒的TCID50值，结果发现当胰酶终浓度为15μg/mL,病毒的吸附时间达1.5h,添加的病毒受体PAPN浓度5μg/mL时，PEDV SC-14株的病毒滴度最高为105.23/0.1mL,进一步优化了SC-14株的繁殖条件。并做了PEDV SC-14株全基因序列测序和分析,对SC-14株的全基因序列与疫苗株CV777进行比对分析，SC-14株属G1b组，统计有5个区域的基因缺失，分别在S基因上的455-457位上缺失3个碱基，ORF1a基因上的88-91位上缺失4个碱基，3398-3421位上缺失24个碱基，ORF1b基因上12501-12521位上缺失21个碱基，ORF3基因上的245-293位上缺失49个碱基，经鉴定定义该毒株为经典野毒株。

目录

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英文缩略词表

第一章 前言

1.1 猪流行性腹泻概况

1.2 病原学

1.3 病毒基因组结构及功能

1.4 PEDV诊断方法的研究进展

1.5 PEDV疫苗的研究进展

1.6 本研究目的与意义

第二章2014-2016年我国华南地区PEDV的流行病学调查

2.1 材料

2.3 方法

2.4 结果

2.5 讨论与小结

第三章 巢式RT-PCR鉴别PEDV变异毒株与经典毒株方法的建立

3.1 材料

3.2 方法

3.3结果

3.4讨论与小结

第四章 猪流行性腹泻病毒SC-14株的分离鉴定及繁殖条件的优化

4.1 材料

4.2方法

4.3结果与分析

4.4 讨论与小结

全 文 总 结

致谢

参考文献

附录硕士研究生期间所获科研成果