ECC菌斑生物膜中白色念珠菌的致龋性及相关基因型的研究

摘要

婴幼儿龋(Early childhood caries，ECC)具有发病率高、进展快且同时波及多颗牙等特点，严重影响患儿的身心健康和生活质量，阐明ECC发病机制和寻找防治策略成为目前研究的重点。传统观点认为，口腔内主要致龋菌为变形链球菌、乳酸杆菌及放线菌。有研究表明，白色念珠菌比变形链球菌、乳酸杆菌等具有更强的潜在致龋性，因此推测白色念珠菌亦为重要的致龋菌之一。现有的研究主要针对变形链球菌与ECC的相关性以及不同基因型变形链球菌致龋性的差别进行探讨。迄今，关于白色念珠菌的致龋能力及其与ECC的相关性、牙菌斑中白色念珠菌基因型的报道较少。
　　 目的：本课题旨在通过分离培养ECC和无龋儿童牙菌斑生物膜中的白色念珠菌，分析白色念珠菌检出率与ECC发生的相关性、白色念珠菌的致龋性及相关影响因素，筛选与ECC相关的白色念珠菌致龋基因型，为阐明白色念珠菌在龋病发生、发展过程所起的作用奠定基础，为ECC的预防及早期干预提供新的思路。
　　 材料与方法：
　　 ①选择广州市四所幼儿园3-5岁的健康儿童363名作为研究对象，ECC组238人，无龋组125人。采集龋坏组织及无龋牙的龈上菌斑，以SC5314标准株作为对照组，应用科玛嘉培养基、芽管试验及厚膜孢子试验对白色念珠菌进行培养鉴定，获得纯化菌株，并运用卡方检验对比分析ECC组与无龋组白色念珠菌检出情况。
　　 ②将纯化的菌株用PBS缓冲液制备成浓度为OD540=1.0的菌液，接种至含不同葡萄糖浓度(0.01mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L)及不同pH值(以0.5为间隔配制pH值为4.0～7.0，含葡萄糖0.1mol/L)的沙氏液体培养基中，37℃、需氧培养48h后，将菌液离心，取上清液，以精密pH计测定白色念珠菌产酸能力(△pH值)，并将菌沉淀用PBS液重悬，测定紫外分光光度仪波长540nm处的吸光度值OD540以评价白色念珠菌的耐酸能力。同时将纯化的菌株用PBS缓冲液制备成浓度为OD540=0.6的菌液，接种至羟基磷灰石表面，并加入不同浓度葡萄糖(0.01mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L)培养基，37℃、需氧培养48h后，对粘附至羟基磷灰石表面的白色念珠菌进行平板培养，采用菌落形成单位计数法(CFU/ml)评价白色念珠菌的粘附能力。
　　 ③应用聚合酶链式反应技术对前期分离纯化的白色念珠菌株进行基因型分析，并比较不同基因型白色念珠菌产酸、耐酸和粘附能力。
　　 结果：
　　 ①白色念珠菌在ECC组和无龋组中检出率分别为44.1％、19.2％，经卡方检验，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 ②ECC组和无龋组的白色念珠菌的产酸和粘附能力随培养基中葡萄糖浓度的升高而增大；当葡萄糖浓度到达0.05mol/L，可使培养液的pH值下降至5.14以下，但白色念珠菌在葡萄糖浓度为0.1mol/L与0.15mol/L时的产酸能力无统计学差异；在同一葡萄糖浓度下，ECC组和无龋组中白色色念珠菌的产酸和粘附能力的差异无统计学意义(P＞0.05)。在不同的pH值条件下，ECC组和无龋组中白色念珠菌的产酸能力和生长情况随培养基初始pH的降低而减弱；在pH值为4.0时，白念珠菌仍能较好生长并进行产酸，而ECC组的产酸和耐酸能力较无龋组强(P＜0.05)。
　　 ③儿童牙菌斑中的白色念珠菌基因型分为A、B、C三型，所占比列分别为61.2％、15.5％、16.7％，B型仅在ECC组中出现；B型和C型的白色念珠菌耐酸能力较A型强(P＜0.05)。
　　 结论：
　　 ①白色念珠菌与ECC的发生密切相关。
　　 ②白色念珠菌的产酸和粘附能力具有葡萄糖浓度依赖性，随葡萄糖浓度升高，白色念珠菌的产酸和粘附能力增强，浓度为0.05mol/L以上的葡萄糖具有较强的致龋性。
　　 ③强耐酸性的白色念珠菌菌株可能起到促进ECC发展的作用。
　　 ④儿童牙菌斑中白色念珠菌的基因型以A型为主，基因型的分布可能与患龋状况有关，且白色念珠菌的基因型可能与其致龋性存在相关性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词表

声明

前 言

第一章 ECC菌斑生物膜中白色念珠菌致龋性的研究

实验一ECC菌斑生物膜中白色念珠菌的分离鉴定

实验二不同浓度葡萄糖对白色念珠菌产酸和粘附能力的影响

实验三不同pH条件下ECC菌斑生物膜中白色念珠菌产酸性和耐酸性的研究

第二章 ECC菌斑生物膜中不同基因型白色念珠菌致龋性的研究

实验一ECC菌斑生物膜中白色念珠菌的基因分型

实验二不同基因型白色念珠菌的致龋性

全文总结

参考文献

综述：母亲在儿童早期龋发生中的影响

致谢