siRNA阻断哮喘小鼠树突细胞共刺激分子CD80、CD86对IL-4的影响

摘要

研究背景:
　　 支气管哮喘(哮喘)是由多种炎性细胞和炎性介质参与的气道慢性炎症性疾病。哮喘的患病率和病死率在全球呈逐年上升趋势，哮喘的治疗给患者带来了沉重的经济负担。糖皮质激素是目前治疗哮喘的最有效药物，但是长期使用激素会导致严重的副作用，有些患者病情严重，用激素不能很好的控制，少部分患者会出现激素治疗无效(激素抵抗型哮喘)，因此我们有必要寻找新的哮喘防治的方法。
　　 哮喘的发病机制比较复杂，其中最经典、最重要的免疫学异常是Th1/Th2细胞失衡，主要表现为Th2型细胞数量的增多和功能亢进，T细胞在诱导哮喘气道炎症反应中起关键的作用。T细胞的活化需要抗原提呈细胞(Antigen PresentingCell，APC)提供的刺激信号，树突状细胞(Dendritic Cell，DC)是体内最主要的APC，是唯一初始型免疫反应细胞，也是最强大的免疫反应诱导物，它能捕获并呈递抗原，启动和诱导T细胞分化，在平衡免疫激活和免疫耐受中起着重要作用。CD80/CD86是表达于DC表面的共刺激分子，高表达共刺激分子CD80/CD86的成熟DC(mDC)诱导T细胞活化，低表达共刺激分子CD80/CD86的未成熟DC(imDC)抑制T细胞反应，诱导免疫耐受。许多研究发现DC表面CD80/CD86的表达与Th2细胞反应及哮喘气道炎症有着密切的关系。
　　 RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)引发的转录后基因沉默过程，普遍存在于真核细胞中，是真核细胞对抗外源基因侵入及自身基因异常表达的一种重要防御机制，具有高特异性、高效性、传递性以及时间依赖性等特点。1998年由Fire等首次发现[11]，以后陆续有许多国内外学者对其进行研究。小分子干扰核糖核酸(siRNA)作为近年研究的热点，不仅被用作探讨细胞基因功能的工具，而且更吸引人的是应用siRNA抑制致病基因的表达，并开发出治疗各类疾病的新型基因药物。RNAi目前已被广泛用于抗病毒、抗肿瘤等方面的研究，其应用于树突细胞和哮喘的防治近年国内外均有报道，应用siRNA阻断哮喘小鼠DC表面共刺激分子CD80、CD86对T淋巴细胞分化影响的研究目前未见报道。
　　 本研究通过应用siRNA抑制哮喘小鼠DC表面共刺激分子CD80、CD86的表达，阻断T细胞活化的共刺激信号，观察siRNA是否对哮喘小鼠DC表面共刺激分子CD80、CD86表达具有抑制作用，探讨siRNA干扰哮喘小鼠DC的CD80、CD86后对Th2型细胞因子IL-4的影响，从而为RNA干扰应用于哮喘治疗提供新的靶位，为哮喘的基因治疗开辟新的途径。
　　 研究目的:
　　 第一部分建立一种从小鼠骨髓中分离培养高纯度树突状细胞(DC)的有效方法，并在体外进行扩增和鉴定。
　　 第二部分应用siRNA阻断DC表面共刺激分子CD80、CD86的表达，探讨siRNA是否对哮喘小鼠DC表面共刺激分子CD80、CD86表达具有抑制作用及siRNA干扰哮喘小鼠DC的CD80、CD86后对Th2型细胞因子IL-4的影响。
　　 实验方法:
　　 1、小鼠骨髓来源树突状细胞(DC)的分离、培养、鉴定。
　　 1.1体外分离培养小鼠骨髓DC
　　 健康6-8周龄SPF级BALB/c小鼠，断颈处死，无菌取出股骨和胫骨，用RMPI-1640培养基反复冲出骨髓，离心弃上清，加入红细胞裂解液裂解红细胞，用含10％的FBS的RMPI-1640完全培养基重悬细胞，接种至6孔板，加入rmGM-CSF和rmIL-4，置于37℃、饱和湿度、体积分数5％CO2培养箱培养。48h后首次全量换液，去除悬浮细胞，补充细胞因子，以后隔日半量换液并补足细胞因子，培养至第7天，收集悬浮细胞，收集前1天加入LPS，可获得成熟DC(mDC)。
　　 1.2小鼠骨髓DC的鉴定
　　 倒置相差显微镜下观察细胞形态和生长情况，流式细胞仪检测DC表面标记的表达。
　　 2、siRNA阻断哮喘小鼠树突细胞共刺激分子CD80、CD86对IL-4的影响
　　 健康6-8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠20只，随机分为2组，分别为正常对照组、哮喘模型组，每组10只。哮喘模型组鸡卵白蛋白(OVA)抗原溶液腹腔注射致敏，OVA溶液雾化吸入激发。正常对照组以生理盐水替代OVA溶液。光镜下观察支气管、肺组织病理变化。分离培养哮喘小鼠骨髓DC，设计合成CD80、CD86相关siRNA序列并转染哮喘小鼠DC，荧光定量RT-PCR、流式细胞术检测干扰前后DC中CD80、CD86mRNA的表达和表面标记物CD80、CD86蛋白的表达，分离健康小鼠T细胞。将干扰组、未干扰组、转染试剂对照组的DC分别与小鼠T淋巴细胞共培养，ELISA检测上清液中Th2分泌因子IL-4的含量。
　　 统计方法:
　　 所有数据均运用SPSS13.0统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示，两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析(One-WayANOVA)，组间两两比较采用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 实验结果:
　　 1、小鼠骨髓DC的培养、鉴定
　　 小鼠骨髓细胞经rm GM-CSF、rm IL-4和LPS诱导培养后获得的DC具有典型的树突状形态，流式细胞术检测imDC细胞和mDC细胞均可高表达CD11c，达80％以上，mDC细胞的CD80、CD86、MHCⅡ的阳性表达率分别为(73.63±8.01)％、(75.85±11.72)％、(84.17±10.91)％，显著高于imDC组细胞的(37.53±9.82)％、(38.29±8.76)％、(68.16±11.92)％(P＜0.05)。
　　 2、siRNA阻断哮喘小鼠树突细胞共刺激分子CD80、CD86对IL-4的影响siRNA转染小鼠DC后，CD80、CD86mRNA表达水平明显降低[(2.09±0.46)vs(0.60±0.17)，(3.58±0.20)vs(0.91±0.48)，P＜0.05]，CD80、CD86阳性表达率显著减低[(82.45±15.80)％vs(30.79±7.07)％，(89.45±10.22)％vs(27.29±6.99)％，P＜0.05]，DC与T淋巴细胞共培养的上清液中IL-4表达水平明显下降[(150.69±29.50)pg/ml vs(93.04±13.13)pg/ml，P＜0.05]。
　　 实验结论:
　　 1、小鼠骨髓细胞经GM-CSF、IL-4和LPS诱导培养后，可获得足量较高纯度具有典型形态特征的DC，为进一步研究DC的功能和特性奠定了基础。
　　 2、哮喘小鼠DC高表达CD80、CD86，siRNA能够有效并且特异地抑制CD80、CD86的表达，从而阻断T淋巴细胞活化的协同刺激信号，减少Th2细胞分化，Th2型细胞因子IL-4分泌减少，诱导免疫耐受。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文对照词汇表

声明

前 言

第一部分小鼠骨髓来源树突状细胞的分离、培养及鉴定

材料和方法

结 果

讨 论

第二部分siRNA阻断哮喘小鼠树突细胞共刺激分子CD80、CD86对IL-4的影响

材料和方法

结 果

讨 论

结 论

参考文献

附 图

致 谢