两种韧皮部杆菌媒介木虱内生原核生物和线粒体基因组研究

摘要

亚洲柑橘木虱Diaphorina citri和马铃薯木虱Bactericeracockerelli是农业生产上的重要害虫。其中亚洲柑橘木虱为候选的韧皮部杆菌“Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas）”和“Ca.L.americanus”的媒介昆虫，该细菌与柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing）密切相关，给全世界柑橘生产造成严重威胁。马铃薯木虱主要为害马铃薯、番茄、辣椒等茄科植物，不仅造成“木虱黄叶病”，还是马铃薯斑马病（Zebra chipdisease）病原“Ca.L.solanacearum（CLso）”的媒介昆虫。这两种病原菌均为难培养细菌，目前没有有效的药剂进行控制，因此对着两种媒介昆虫的研究和从基因组中获取有用的生物信息对防控柑橘黄龙病和马铃薯斑马病有着重要的指导作用。本文首先探索亚洲柑橘木虱和马铃薯木虱的人工饲养方法和获取韧皮部杆菌的规律，得到带菌量高的木虱DNA样品并用于第二代测序（Next Generation Sequencing，NGS），组装两种媒介昆虫所携带的内生原核生物和线粒体基因组，并进一步分析和应用。具体研究内容及结果如下：
　　（1）通过比较九里香Murraya exotica、酸橘Citrus sunki和马水橘Citrus reticulate三种寄主不同成熟度的梢对柑橘木虱各龄若虫和成虫存活率的影响，发现柑橘木虱若虫的生长发育依赖于嫩梢，而成虫在成熟梢上的存活率高于嫩梢，且酸橘上饲养效果较好。
　　通过研究两个番茄Solanum lycopersicum品种（“Big boy”和“Yellow pearl”）对马铃薯木虱若虫和成虫生物学特性的影响，发现马铃薯木虱在“Yellow pearl”上的4龄若虫和产卵前期更短，且若虫总存活率和成虫存活率显著高于“Big boy”。
　　（2）亚洲柑橘木虱和马铃薯木虱的若虫期获菌率和获菌量均高于成虫期，分别在饲菌后第6 d和第12 d开始达到显著性差异。马铃薯木虱成虫获菌效率远高于亚洲柑橘木虱，第18 d已达90％，且CT值显著下降，而亚洲柑橘木虱只达到33.33%，CT值仍没有显著变化，此时马铃薯木虱的韧皮部杆菌拷贝数约为亚洲柑橘木虱的3倍。
　　（3）通过两种木虱的测序文库进行组装得到内生原核生物基因组，其中亚洲柑橘木虱样本中获得柑橘黄龙病病原细菌CLasYCPsy株系，原生共生菌“Ca.Carsonella ruddii”YCCR株系，次生共生菌“Ca.Profftella armature”YCPA株系的染色体和质粒基因组；另外在该样本组装序列中找到与Wolbachia sp.相关的291个序列。
　　马铃薯木虱样本中获得马铃薯斑马病病原细菌CLso RSTM株系，并首次报导了原生共生菌“Ca.C.ruddii”BC株系和与次生共生菌Wolbachiasp.相关的605个序列。
　　（4）首次获得亚洲柑橘木虱和马铃薯木虱完整的线粒体基因组。其中采自美国加利福尼亚州的马铃薯木虱线粒体全基因组大小为15220 bp，采自中国广东省和美国加利福尼亚州的亚洲柑橘木虱线粒体全基因组分别为14996和15013 bp。三个线粒体基因组均含有13个蛋白编码基因、2个核糖体RNA基因、22个转移RNA基因和1个控制区。基因排序均与昆虫原始线粒体的顺序相同。
　　通过对马铃薯木虱与GenBank数据库现有三种木虱（枸杞木虱Paratrioza sinica，木通木虱Cacopsylla coccinea和朴树木虱Pachypsylla venusta）线粒体基因组的13个基因的核酸多态性进行分析，发现cox1基因最保守；对这4个基因组控制区进行比对，发现马铃薯木虱多出一段260 bp的特异序列，并能形成3个茎环二级结构。基于13个蛋白编码基因构建系统发育树，其结果与基于形态学的分类结果一致。
　　采自中国广东省和美国加州的亚洲柑橘木虱的线粒体基因组存在52个变异碱基。通过3种方法（cox1基因、trnAsn基因和利用3个nad基因的常规PCR）验证采自中国和美国多个地区的木虱样品，结果表明加利福尼亚州的亚洲柑橘木虱样品可能来源于美国东部地区，为当地黄龙病防控起到理论的指导作用。此外，通过两个地区的线粒体基因组的保守区域设计了20对引物，用于扩增采自全球各地区的亚洲柑橘木虱线粒体全基因组，并发现同个样品线粒体的控制区可能存在多种形态。完整的木虱线粒体基因组可更好地应用到种群多态性和系统发育分析当中，具有巨大的应用价值。

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目录

1前言

1.1研究背景

1.2本研究的目的和意义

1.3研究技术路线

2亚洲柑橘木虱和马铃薯木虱的饲养

2.1引言

2.2材料与方法

2.3结果与分析

2.4小结

3亚洲柑橘木虱和马铃薯木虱的饲菌方法及获菌规律研究

3.1引言

3.2材料与方法

3.3结果与分析

3.4小结

4亚洲柑橘木虱和马铃薯木虱内生原核生物的研究

4.1引言

4.2材料与方法

4.3结果与分析

4.4小结

5比较马铃薯木虱与三种已知木虱的线粒体基因组

5.1引言

5.2材料与方法

5.3结果与分析

5.4小结

6不同地区亚洲柑橘木虱线粒体基因组的比较分析

6.1引言

6.2材料与方法

6.3结果与分析

6.4小结

7结论与讨论

7.1结论

7.2讨论

7.3主要创新点

7.4后续工作计划

致谢

参考文献

附录A 本文使用到的附图

附录B本文使用到的附表

附录C 基因COG分析中字母代表信息

附录D 本文所编写的编程脚本

附录E 博士期间发表论文情况