百合樱草糖苷酶调节沉香醇节律释放的研究

摘要

百合为多年生草本球根植物，其花型较大、花色多样且花香浓郁，在世界鲜切花市场占有重要的地位。西伯利亚‘百合（Lilium‘Siberia’）属于东方百合杂种系，能够释放沉香醇等游离态花香物质。游离态花香物质在植物体内可以糖苷键合态前体形式存在，在适当条件下转变成游离态释放出来，糖苷酶在其中可起到关键作用。本研究以不同光暗条件下?西伯利亚‘百合为材料克隆了樱草糖苷酶基因，并通过原核表达、重组蛋白酶活性鉴定、实时荧光定量PCR、GC-MS和UPLC-Q-TOF-MS等技术和方法，研究了光对樱草糖苷酶基因LoPRI的表达及游离态和糖苷键合态沉香醇含量变化的影响，为探究?西伯利亚‘百合香气形成和沉香醇昼夜节律释放调控的分子机理奠定理论基础。主要研究结果如下：
　　1．采用RT-PCR技术，从百合花瓣中克隆了樱草糖苷酶基因 LoPRI基因。该基因长度为1482bp，编码493个氨基酸，蛋白分子量为64472.78Da，等电点(pI)为5.28。LoPRI含有NEP和ITENG结构域，属于糖苷水解酶家族1成员。
　　2.构建了 LoPRI原核表达载体，诱导表达获得纯化的重组 LoPRI蛋白，通过对百合花瓣的键合态糖苷前体物质进行体外催化反应，固相微萃取挥发性物质并通过GC-MS鉴定获得大量酶催化产物沉香醇；另外采用UPLC-Q-TOF-MS鉴定出?西伯利亚‘百合花朵中与沉香醇结合的糖苷键合态前体花香物质仅有樱草糖苷-沉香醇复合物，进一步明确 LoPRI是樱草糖苷酶，催化樱草糖苷-沉香醇复合物的糖苷键裂解，释放沉香醇。
　　3．采用荧光定量PCR技术分析了LoPRI的时空表达规律。研究结果发现LoPRI在?西伯利亚‘百合的器官中均表达，其表达水平在花瓣与萼片中接近，表达量最高，其次为根和叶，鳞茎表达量最低；随着花的开放，LoPRI表达量逐渐增加，盛开期达到最高，衰败期又降低。在72 h的12h光照/12h黑暗以及持续光照条件下，LoPRI表达量都在16 PM达到最高峰，而在晚上24PM到4 AM表达量最低，表现了相似的节律性。72h无光照条件下，该基因的表达量显著降低，并出现表达节律提前的现象。
　　4.采用GC-MS和 LoPRI体外催化技术分别测定了在72h不同时间点12h光照/12h黑暗、持续光照和持续全黑暗条件下，沉香醇挥发量和樱草糖苷-沉香醇复合物的含量变化。研究结果表明，沉香醇的释放在16PM达到最大值，4AM释放量最低，而樱草糖苷-沉香醇复合物含量却是16PM达到最低值，4AM是含量最高时间点，具备相反的昼夜节律性。恒定黑暗下，沉香醇释放量和樱草糖苷-沉香醇复合物含量都很低。说明光照对两者的含量都有重要影响，且LoPRI是调控沉香醇节律释放的关键基因。

目录

声明

缩略词中英文对照表

1 前言

1.1 植物萜类花香物质合成和代谢调控

1.2 植物游离态香气物质和糖苷键合态香气前体物质

1.3 植物昼夜节律钟及花香物质节律性释放

1.4 研究目的与意义

2.1 植物材料

2.2 药品和试剂

2.3 仪器设备

2.4 '西伯利亚'百合主要花香物质的释放规律

2.5 基因克隆和表达量分析

2.6 LoPRI的原核表达及功能分析

3 结果与分析

3.1 基因克隆和生物信息学分析

3.2 LoPRI蛋白原核表达及功能分析

3.3 百合花朵中糖苷前体花香物质分析

3.4 百合樱草糖苷酶基因的时空表达特性分析

3.5 百合游离态沉香醇及糖苷键合态沉香醇含量的昼夜节律性变化

4.1 讨论

4.2 结论

4.3 进一步的研究设想

致谢

参考文献

附录A：引物序列

附录B：LoPRI、GAPDH荧光定量标准曲线和溶解曲线

附录C：攻读硕士学位期间的科研成果