线粒体融合与分裂在改善C2C12肌管胰岛素抵抗中的作用

摘要

目的：
　　通过棕榈酸(Palmitate,PA)孵育离体培养C2C12肌管建立胰岛素抵抗（Insulin Resistance,IR）模型，以Drp1抑制剂（mdivi-1）干预线粒体分裂蛋白Drp1活性，观察骨骼肌细胞线粒体融合与分裂变化对线粒体功能的影响，探讨骨骼肌线粒体融合与分裂改变在改善IR中的作用和意义。
　　方法：
　　1）C2C12小鼠成肌细胞在37℃，5％CO2采用DMEM增殖培养基（含10%FBS）培养，至细胞密度达到80%-90%时换为DMEM分化培养基（含2%马血清）继续培养5-6天，每24h换液一次。
　　2）肌管分化完成后随机分为对照组（C）、PA孵育组（P）、Drp1抑制剂(mdivi-1,IC50=50μM)组（M）和Drp1抑制剂+PA孵育组（PM）。其中P组为肌管在0.75mM PA孵育介质中孵育16h或24h；M组为24h孵育过程结束前2h加入50μM mdivi-1。 PM组为肌管经0.75mM PA孵育24h过程中，在孵育结束前2h加入50μM mdivi-1。
　　3）用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法（GOD-POD）检测孵育介质剩余葡萄糖浓度间接评价肌管胰岛素刺激的糖摄取能力。
　　4）Western Blot检测线粒体融合与分裂蛋白Mfn2、Opa1，Drp1蛋白含量。
　　5）采用Oxygraph-2k（Oroboros,Austria）评价肌管呼吸功能。
　　结果：
　　1）PA诱导肌管IR模型的建立：与C组相比，经0.75mM PA孵育16h或24h后，P组肌管糖摄取能力显著下降（p<0.05）；
　　2）PA作用下肌管线粒体融合与分裂蛋白含量的变化：经0.75mM PA孵育24h后，P组肌管线粒体融合蛋白Mfn2，Opa1蛋白含量显著低于C组（p<0.01）；而线粒体分裂蛋白Drp1蛋白含量则显著增加（p<0.01）；
　　3）PA作用下肌管呼吸功能的变化：经0.75mM PA孵育24h后，P组肌管单位时间内耗氧量显著低于C组（p<0.01）；
　　4）Drp1抑制剂对肌管糖摄取浓度的影响：与C组相比，M组肌管糖摄取浓度显著下降（p<0.01）；PM组肌管糖摄取浓度也显著下降（p<0.01）；在孵育结束前用50μM Mdivi-1处理2h的肌管中，与M组相比，PM组糖摄取浓度显著升高（p<0.05）；
　　5）Drp1抑制剂对肌管呼吸功能的影响：与C组相比，M组肌管单位时间内耗氧量显著下降（p<0.01）；PM组肌管单位时间内耗氧量也显著下降（p<0.01）；在孵育结束前用50μM mdivi-1处理2h的肌管中，与M组相比，PM组单位时间内耗氧量显著升高（p<0.05）；
　　6）Drp1抑制剂对肌管线粒体融合与分裂蛋白含量的影响：M组、PM组线粒体融合蛋白Mfn2、Opa1蛋白含量比C组显著下降（p<0.01）；PM组线粒体分裂蛋白Drp1蛋白含量比C组显著下降（p<0.01），而M组与C组无显著性差异（p>0.05）。
　　结论：
　　1）肌管经0.75mM PA孵育16h或24h均可诱导为IR模型，表现为胰岛素刺激的糖摄取能力下降；
　　2）在肌管IR模型中，肌管线粒体融合蛋白含量减少而分裂蛋白含量增加，提示线粒体融合与分裂动态平衡可能受到破坏，线粒体过度分裂；同时，肌管呼吸功能减弱也提示线粒体功能受损。
　　3）通过Drp1抑制剂可以纠正IR模型的线粒体融合与分裂失衡状态，改善线粒体呼吸功能，明显增强IR肌管糖摄取能力。
　　研究提示骨骼肌线粒体融合与分裂在改善IR中有重要作用。通过Drp1抑制剂调控线粒体融合与分裂的动态平衡可能是IR干预的分子机制之一。线粒体融合与分裂如何调节IR状态下肌管糖摄取能力的作用机制仍需要进一步的研究。

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中文摘要

英文摘要

1、前言

2 实验材料及研究方法

2.1 实验材料

2.2 研究方法

2.2.1 C2C12 小鼠骨骼肌成肌细胞增殖培养

2.2.2 细胞传代

2.2.3 细胞冻存与复苏

2.2.4 C2C12成肌细胞诱导分化培养

2.2.5 PA诱导肌管IR模型

2.2.6 Drp1抑制剂的作用

2.2.7 肌管呼吸功能测定

2.2.8 肌管线粒体融合与分裂蛋白含量的测定

2.2.9 数据处理

3. 实验结果

3.1 C2C12成肌细胞的增殖及诱导分化培养

3.2 PA诱导肌管IR模型的建立

3.3 PA作用下肌管线粒体融合与分裂蛋白含量的变化

3.3.1 对肌管线粒体融合相关蛋白含量的影响

3.3.2 对肌管线粒体分裂蛋白Drp1含量的影响

3.4 PA作用下肌管呼吸功能的变化

3.5 Drp1抑制剂（mdivi-1）对IR肌管的影响

3.5.1 对肌管糖摄取能力的影响

3.5.2 对肌管呼吸功能的影响

3.5.3 对肌管线粒体融合与分裂蛋白的影响

4 讨论

4.1 PA诱导肌管IR模型的建立

4.2 PA在诱导肌管IR过程中的可能作用

4.3线粒体融合与分裂在肌管IR发生中的作用

4.4 Drp1抑制剂的作用

5. 结论

文献综述

附录

参考文献

致谢

研究生个人简历