非血缘脐血移植后发生植入前综合征效应细胞的探索

摘要

目的：
　　植入前综合征（PES）是一种高发于非血缘脐血移植（UCBT）后在中性粒细胞植入之前，以发热、皮疹、腹泻等为主要临床表现的一种免疫反应。发生重症PES的患者，移植相关死亡率明显增高。本研究通过对UCBT后发生PES患者外周血进行供受者基因嵌合状态检测，了解发生PES时细胞的来源；根据血清细胞因子检测结果发现可溶性ST2（sST2）在PES发生时明显升高，选择新鲜脐血和外周血干细胞，采用IL-33和sST2进行体外刺激，探索发生PES的效应细胞，为PES发病机制的研究奠定基础。
　　方法：
　　本研究分为两部分。
　　第一部分：UCBT后发生PES的细胞来源的研究。根据本中心先前的研究发现UCBT后PES发生的中位时间为UCBT后第7天（+7d），选择移植患者+7d的外周血标本，采用短串联重复序列聚合酶链式反应（STR-PCR）技术检测发生PES组和未发生PES组患者供受者嵌合状态，分析发生PES的细胞来源。
　　第二部分：UCBT后发生PES的效应细胞的探讨。一、UCBT后PES发生时各种免疫细胞及其亚群和相关细胞因子的检测。检测PES发生时的T、B、NK和单核细胞及其亚群的变化；检测患者移植前、移植当天、PES发生时不同时间点的外周血的白细胞数，血浆C-反应蛋白和血清中相关细胞因子的变化。二、不同来源的移植物体外刺激实验：sST2在PES发生时显著增高，而ST2是IL-33的孤儿受体，拟从IL-33/ST2信号通路来推证PES的效应细胞。应用 IL-33,sST2刺激新鲜脐血、外周血干细胞（动员采集的同胞供者），每种类型的细胞分4组：实验组：A．IL-33+sST2组；对照组：B．sST2组；C．IL-33组；D．空白组。经体外培养0、12、24和72小时后，细胞计数板计算刺激前后细胞总数，流式细胞术检测刺激前后细胞亚群及ST2受体表达情况。
　　结果：
　　第一部分 UCBT后发生PES的细胞来源的研究
　　STR-PCR检测脐血及受者移植前后的标本比对供受者的嵌合状态，结果显示：UCBT+7d供者的嵌合度发生PES组明显高于未发生PES组，分别为70.58±22.86%与37.18±18.96%，两组之间有显著的统计学差异，P＜0.0001。
　　第二部分 UCBT后发生PES的效应细胞的探讨
　　一、UCBT后发生PES时各种免疫细胞及其亚群和相关细胞因子的检测
　　1.白细胞的变化PES组与无PES组在移植前、移植当天、PES发生时的白细胞计数组间无统计学差异，P＞0.05。
　　2.PES发生时T、B、NK和单核细胞的细胞亚群检测结果：CD45+CD3+T淋巴细胞、CD45+CD3-CD19+B淋巴细胞、CD45+CD3-CD56+NK细胞、CD45+CD3-CD14+单核细胞分别占90%，0.3%，2.1%和0.2%。PES组与无PES组的T、B、NK和单核细胞的各细胞亚群比例无明显统计学差异，P＞0.05。
　　3.C-反应蛋白的变化在移植前、移植当天、PES发生时，PES组和无PES组两组之间无显著统计学差异，P＞0.05。
　　4.血清细胞因子的变化
　　发生PES时细胞因子IL-6、MCP-1和sST2在PES组明显高于无PES组（P<0.05）；PES组自身比较患者发生PES时也显著高于移植前、移植当天的水平（P<0.05）。PES患者治疗有效者细胞因子IL-6和MCP-1明显下降并恢复至发生前水平（P<0.01），而sST2与PES发生时相比虽有所下降但无统计学差异（P＞0.05）。
　　发生PES时IFN-γ、IL-2、IL-1Rα、IL-4、IL-8、IL-17A、IL-33、MIP-1α、MIP-1β和TNF-α表达水平两组相近无统计学差异（P>0.05），同时PES组患者在不同的时间点，自身对比其表达水平相近无统计学差异（P>0.05）。
　　二、不同来源的移植物体外刺激实验
　　1.细胞数量的变化：新鲜脐血和外周血干细胞经IL-33、sST2刺激培养后，各组刺激前后细胞数量无明显增加（P>0.05），两种来源不同的细胞刺激培养12h后均出现多形性变化，此后随培养时间延长形态变化不显著。
　　2.T、B、NK和单核细胞各亚群的变化：新鲜脐血经Ficoll提取单个核细胞后，脐血提取的单个核细胞比例分别为T淋巴细胞30-50%、B淋巴细胞1-3%，NK细胞5-8%，单核细胞5-13%。外周血干细胞中T淋巴细胞20-35%、B淋巴细胞2-5%，NK细胞3-9%，单核细胞18-32%。经刺激培养12、24和72h后，四组的T、B、NK和单核细胞亚群比例无明显差异（P>0.05），随着培养时间的延长，有少量细胞凋亡，实验各组细胞不同培养时间点的细胞亚群比例也无明显统计学差异（P>0.05）。
　　3.T、B、NK和单核细胞ST2受体表达情况：新鲜脐血和外周血干细胞中ST2受体表达相似，单核细胞上ST2受体表达量高达53-90%，其次是B淋巴细胞亚群约为30-60%，T淋巴细胞及NK细胞亚群表达量低，分别为2-5%和3-10%。而四组的各细胞亚群ST2受体表达无明显变化（P>0.05），实验各组细胞不同培养时间点的各细胞亚群ST2表达也无显著变化（P>0.05）。
　　结论：
　　1.UCBT后PES是供者开始植入时引发多种细胞因子参与的免疫反应，其效应细胞推测来源于供者，供者的早期嵌合是PES发生的高危因素。
　　2.血清中单核细胞相关的趋化因子（MCP-1）在PES发生时明显升高，而淋巴细胞相关的较特异的细胞因子（IL-2、IL-4、IL-8、IL-17A）在PES发生时无显著变化，PES的临床表现主要在皮肤、肠道等组织中，推断组织中的单核巨噬细胞可能是PES的主要效应细胞。
　　3.加入IL-33和sST2进行单纯的体外培养，未见到免疫细胞的增殖和ST2受体表达的增高，但不能确定细胞因子水平是否发生变化，需进一步检测细胞培养液中细胞因子的变化，观察IL-33/ST2信号通路及sST2是否对下游细胞信号转导存在影响，从而引起细胞因子的分泌。同时本实验也需要加测各免疫细胞活化的指标，如HLA-DR,CD27，CCR等等，为揭示PES的发生机制提供依据。

目录

声明

英文缩略词表

引言

1 材料与方法

1.1 研究对象：

1.2 实验方法

2.结果

2.1 PES组与对照组患者一般情况的比较

第二部分：UCBT后发生PES的效应细胞的探讨

一、UCBT后PES发生时各种免疫细胞及其亚群和相关细胞因子的检测。

1材料与方法

2.结果

二、不同移植物来源体外刺激实验

1.引言

2 材料与方法

3.结果

讨论

结论

参考文献

附录个人简历

致谢

综述:脐血移植后植入前综合征研究进展