血浆长链非编码RNAs作为系统性红斑狼疮生物标志物的分子流行病学研究

摘要

背景：
　　系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）具有复杂的遗传背景，涉及编码基因和非编码基因，过去普遍认为编码基因在疾病的发生发展中起重要作用，但很少关注基因组中的非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA）。按长度大小，具有调控作用的ncRNA主要分为两类：≤200 nt的短链非编码RNA（主要为微小 RNA（microRNA,简称 miRNA））和>200 nt的长链非编码 RNA（long non-coding RNA, lncRNA）。大量研究表明miRNA在SLE的发病过程中发挥着关键作用，可作为一种新型生物标志物用于SLE的诊断和预后评估。
　　与miRNA相比，lncRNA的种类繁多且数量庞大，能够从表观遗传水平、转录水平、转录后水平和蛋白质代谢等多个层面调控基因表达。LncRNA在人类多种疾病的发生发展过程中也起着非常重要的调控作用。新近研究表明，在SLE患者外周血单核细胞中，linc0949（ENST00000500949）和 NEAT1（nuclear enriched abundant transcript1）的表达水平明显异常，且与疾病活动度和肾脏受累有关，NEAT1通过丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）通路，促进相关趋化因子和炎症因子的表达，进而参与SLE的发病过程。
　　由于SLE临床表现复杂多样，病情反复多变，早期诊断困难，因此迫切需要寻求一种新型、特异性及敏感性较高的生物标志物用于SLE的诊断和预后评估。研究证实lncRNA在血浆中稳定存在，可作为肿瘤和心血管疾病的早期生物标志物和治疗靶点，用于疾病的早期筛查、诊断和预后评估。然而目前，关于lncRNA在SLE患者中的研究还很有限，且探讨血浆lncRNA作为SLE疾病易感性标志物的研究尚未见报道。
　　目的：
　　筛选在SLE患者血浆中异常表达的lncRNAs，并进行独立验证，评估差异血浆lncRNAs作为SLE辅助诊断的生物标志物的价值；利用生物信息学分析，对差异lncRNAs进行功能预测，探讨其在SLE发病中的作用机制。
　　方法：
　　本研究共分为两部分：
　　第一部分：SLE患者血浆差异lncRNAs的筛选、验证及作为生物标志物的价值本部分采用的是四阶段病例?对照设计：
　　第一阶段：收集新发SLE非肾炎患者、新发狼疮肾炎（lupus nephritis, LN）患者和正常对照血浆各12例，各组每4例血浆总RNA等量混合，即形成每组各3份血浆总RNA池。利用lncRNA芯片检测血浆lncRNA表达谱，筛选差异lncRNAs。
　　第二阶段：小样本初步验证，在原单个血浆标本中，采用定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR）技术，对从芯片中筛选出的10个候选差异lncRNAs和根据文献挑选的5个候选lncRNAs（ENST00000500597: linc0597; ENST00000500949: linc0949; ENST00000449289:GAS5或lnc9289;ENST00000587298:lnc-DC;ENST00000495032:HOTAIRM1）的表达水平进行初步验证。
　　第三阶段：大样本独立验证，另收集240例SLE患者和120例正常对照的血浆标本，随机分为训练组（SLE患者160例，正常对照80例）和测试组（SLE患者80例，正常对照40例）。
　　首先，在训练组中，采用qRT-PCR技术检测从小样本初步验证中得到的差异lncRNAs；然后，在测试组中，应用 qRT-PCR技术对从训练组中验证出的差异lncRNAs给予进一步验证；最后，在240例SLE患者中，探讨最终验证出的差异lncRNAs与主要临床指标的关联性。
　　此外，为了评价血浆差异lncRNAs单个或组合作为SLE生物标志物的价值，我们首先采用受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线分析各单个差异lncRNAs的诊断价值，然后基于训练组，应用logistic回归分析构建预测SLE风险的lncRNAs联合判别模型，并在训练组和测试组中，采用ROC曲线分析探讨其联合诊断价值。
　　最后，我们在240例SLE患者中，按照有无肾炎将SLE患者分为LN组和SLE非肾炎组，应用logistic回归分析构建预测LN风险的lncRNAs联合判别模型，采用ROC曲线分析探讨血浆差异lncRNAs单个或组合作为鉴别LN和SLE非肾炎生物标志物的价值。
　　第四阶段：应用qRT-PCR技术检测差异lncRNAs在疾病对照组（类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）患者30例，原发性干燥综合征（primary Sjogren's syndrome, pSS）患者31例）血浆中的表达情况，评估差异lncRNAs作为SLE生物标志物的特异性，并采用ROC曲线分析对联合判别模型的诊断价值给予进一步验证。
　　第二部分：SLE相关mRNAs及lncRNAs的生物信息学研究
　　对lncRNA芯片建立的 SLE患者血浆 mRNA差异表达谱，进行基因本体论（gene ontology, GO）和 KEGG生物学途径（Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway）分析；同时结合qRT-PCR验证结果，建立差异lncRNA-mRNA共表达网络分析；采用竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA, ceRNA）分析，构建mRNA-miRNA-lncRNA调控网络，探寻可作为ceRNA的lncRNA。
　　结果：
　　第一部分：SLE患者血浆差异lncRNAs的筛选、验证及作为生物标志物的价值
　　本研究通过lncRNA芯片建立了SLE非肾炎和LN的血浆lncRNA和mRNA差异表达谱（差异倍数≥2倍，P≤0.05），从中筛选出10个候选血浆差异表达lncRNAs，并结合文献挑选的5个候选lncRNAs进行小样本初步验证。
　　小样本初步验证发现，与正常对照相比，在SLE患者血浆中15个候选lncRNAs（ENST00000450640: lnc0640; ENST00000583643: lnc3643; ENST00000584688:lnc4688; ENST00000425150: lnc5150; ENST00000506655: lnc6655; NR_027074:lnc7074;ENST00000507514:lnc7514;ENST00000458228:lnc8228;ENST00000519603:lnc9603;uc001agf.1:lncagf.1;GAS5;linc0597;linc0949;lnc-DC;HOTAIRM1）中共有9个 lncRNAs（GAS5, linc0597, lnc0640, lnc5150, lnc3643, lnc6655, lnc7074, lnc7514, lncagf.1）的表达水平存在显著变化（均有P<0.05）。
　　大样本独立验证进一步确定了在训练组和测试组的血浆样本中，linc0597、GAS5、lnc0640、lnc5150和lnc7074的表达水平均显著变化（均有P<0.05）。且在训练组和测试组中，LN患者与SLE非肾炎患者比较，lnc7074、lnc3643、lnc0640、lnc7514和lnc6655的表达水平均显著上调（均有P<0.05）。
　　关联性研究结果显示血浆linc0597和GAS5的表达水平与C3水平均呈显著负相关（分别为P<0.001和P=0.009）；lnc5150的表达水平与血小板减少和C3水平显著相关（分别为P=0.008和P=0.001）；lnc0640的表达水平与低补体、血小板减少和C3水平显著相关（分别为P=0.001、P=0.017和P<0.001）；lnc7074的表达水平与血小板减少和C3水平显著相关（分别为P=0.028和P<0.001）。
　　在训练组中，血浆 linc0597、GAS5、lnc0640、lnc5150和 lnc7074作为 SLE生物标志物的ROC曲线下面积（area under the curve, AUC）分别为0.634、0.824、0.598、0.625和0.602，5个lncRNAs组合预测SLE风险的判别公式为logit(P=SLE)=?2.594+7.503× linc0597?14.253× GAS5+2.853× lnc5150?7.012× lnc7074+6.233× lnc0640，AUC为0.966。在测试组中，血浆linc0597、GAS5、lnc0640、lnc5150和lnc7074作为SLE生物标志物的AUC分别为0.649、0.851、0.615、0.683和0.662，联合判别模型的AUC为0.968。
　　与测试组SLE患者相比，在RA患者的血浆中，GAS5和linc0597的表达水平均显著上调（均有P<0.05）；在pSS患者的血浆中，GAS5和lnc7074的表达水平均显著上调（均有P<0.05）。在测试组SLE患者和RA患者中，联合判别模型的AUC为0.683；在测试组SLE患者和pSS患者中，联合判别模型的AUC为0.910；在测试组SLE患者和RA患者+pSS患者中，联合判别模型的AUC为0.798。
　　在240例SLE患者中，肾炎组和非肾炎组相比，血浆lnc0640、lnc3643、lnc5150、lnc6655、lnc7074和lnc7514的表达水平均显著上调（均有P<0.05）。lnc0640、lnc3643、lnc5150、lnc6655、lnc7074和lnc7514用于鉴别LN和SLE非肾炎的AUC分别为0.644、0.671、0.601、0.631、0.665和0.684；lnc3643、lnc5150和lnc7514可联合作为鉴别LN和SLE非肾炎的生物标志物，3个lncRNAs预测LN风险的联合判别公式为logit(P=LN)=?0.139+1.387× lnc3643?2.048× lnc5150+1.647× lnc7514，AUC为0.716。
　　第二部分：SLE相关mRNAs及lncRNAs的生物信息学研究
　　GO分析结果显示，在SLE患者下调的血浆mRNAs中，“ion homeostasis”、“cation transmembrane transporter activity”和“plasma membrane part”分别在生物过程（biological process, BP）、分子功能（molecular function, MF）和细胞组分（cellular component, CC）中富集程度最高；在SLE患者上调的血浆mRNAs中，“cell-cell signaling”、“anion:cation symporter activity”和“cell periphery”分别在BP、MF和CC中富集程度最高。
　　KEGG Pathway分析结果显示，在 SLE患者下调的血浆 mRNAs中，“axon guidance- Homo sapiens(human)”通路富集程度最高；在 SLE患者上调的血浆mRNAs中，“MAPK signaling pathway-Homo sapiens(human)”通路富集程度最高。
　　LncRNA-mRNA共表达网络分析结果显示，GAS5、lnc0640、lnc5150、lnc7074、lnc3643、lnc6655和lnc7514分别与174、18、48、30、36、28和20个mRNAs有较一致的表达模式（Pearson相关系数≥0.935）。其中，DUSP4（dual specificity phosphatase4）、ARRB2（arrestin beta2）和RPS6KA5（ribosomal protein S6 kinase A5）可能分别是 GAS5、lnc0640和 lnc5150正向调控的靶基因，GAS5、lnc0640和lnc5150可能均通过MAPK通路参与SLE的发病过程；C4orf26（chromosome4 open reading frame26）可能为lnc0640、lnc5150、lnc6655和lnc7074共同作用的靶基因；PARP16（poly(ADP-ribose) polymerase family member16）可能为lnc3643、lnc5150、lnc6655和lnc7074共同作用的靶基因。
　　CeRNA分析结果显示，GAS5、lnc0640、lnc3643、lnc6655和lnc7074可作为ceRNA与预测靶基因竞争靶向miRNAs，进而影响靶向miRNAs对其预测靶基因的调控。
　　结论：
　　1.与正常对照相比，SLE患者血浆中GAS5和lnc7074表达水平显著下调，linc0597、lnc0640和lnc5150表达水平显著上调；SLE患者血浆中linc0597和GAS5的表达水平显著低于RA患者，GAS5和lnc7074的表达水平显著低于pSS患者；
　　2.血浆linc0597、GAS5、lnc0640、lnc5150和lnc7074联合有望作为SLE潜在的生物标志物；lnc3643、lnc5150和lnc7514联合有望作为鉴别LN和SLE非肾炎潜在的生物标志物；
　　3. GAS5、lnc0640和lnc5150可能通过MAPK通路参与SLE的发病过程；
　　4. GAS5、lnc0640、lnc3643、lnc6655和lnc7074可能作为ceRNA，影响靶向miRNAs对其预测靶基因的调控。

目录

声明

英文缩略词表Abbreviation

1 前言

2 材料与方法

2.1 研究设计

2.2 研究对象的选取

2.3 资料的收集

2.4 血浆的收集

2.5 主要实验器材和试剂

2.6 实验方法

2.7 数据处理与统计分析

2.8 生物信息学分析

2.9 质量控制

3 结果

3.1 lncRNA芯片初筛

3.2 qRT-PCR初步验证

3.3 qRT-PCR大样本独立验证

3.4 差异lncRNAs在SLE疾病对照中的验证

3.5 差异lncRNAs单个或组合作为SLE生物标志物的价值

3.6 差异lncRNAs单个或组合作为鉴别LN和SLE非肾炎生物标志物的价值

3.7 生物信息学分析

4 讨论

4.1 SLE患者血浆差异lncRNAs的筛选、验证及作为生物标志物的价值

4.2 SLE相关mRNAs及lncRNAs的生物信息学研究

5 结论

参考文献

附录

致谢

综述:长链非编码RNA在风湿性疾病中的免疫调节作用

附件