放射损伤细胞中高尔基体弥散现象及其机制的研究

摘要

高尔基体是细胞内膜系统中重要的细胞器，参与了细胞内蛋白质的加工、分泌和囊泡运输等过程。近年发现，DNA损伤可以引起高尔基体的重组，使其片段化并分散到整个细胞之中，并认为这种高尔基体结构的变化可能与受照细胞的存活有关。尽管此研究结果发表在著名的“细胞”杂志上，但相关领域的研究报道到目前为止仍然很少。高尔基体的结构变化是否真正参与了细胞存活反应，或仅仅是细胞放射损伤后亚细胞结构发生的一种伴随反应，本文将以此为切入点，探索放射损伤后高尔基体的弥散现象以及对其机制进行探讨。
　　目的：
　　通过观察辐射对高尔基体形态结构的影响，了解高尔基体弥散的机制以及对弥散效应和生物学意义进行初步探讨。
　　方法：
　　采用免疫荧光技术检测放射损伤细胞中高尔基体弥散现象并对弥散面积进行统计分析，流式细胞术检测细胞周期变化，克隆形成实验分析细胞存活率，Western Blot检测高尔基体蛋 GOLPH3及 DNA断裂损伤标志物γH2AX的表达，采用RT-PCR检测辐射细胞后miRNA分子 miR-378e、miR-486-3p表达变化及其靶蛋白GOLPH3L、MYO18A表达变化。
　　结果：
　　免疫荧光检测结果显示，照射后高尔基体的弥散面积增加，具有一定的剂量效应和时间效应关系；具有激活 DNA-PKcs的放射损伤防护剂香兰素衍生物VND3207能够减轻γ射线对高尔基体的损伤，其表现为与未加药组相比，VND3207能抑制不同剂量照射后高尔基体弥散面积的增加，同时促进了受照细胞的存活；细胞周期测定结果显示，4Gyγ射线照射后G2/M期阻滞峰值出现在12h左右；免疫印迹结果显示DNA损伤引起的G2/M期阻滞也在12h后解除；而高尔基体弥散在细胞周期阻滞解除后如照射后24h甚至更长时间仍然存在。
　　RT-PCR结果显示，4Gy、10Gy照射后，人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中miR378e、miR486-3p和GOLPH3L及MYO18A mRNA分子有表达上调的趋势，12h趋势明显；免疫荧光检测结果显示，转染miR378e、miR486-3p、siGOLPH3L后的细胞中，高尔基体呈现弥散的趋势；细胞周期结果显示，转染 siGOLPH3L、siMYO18A能延长细胞照射后G2/M期的阻滞；同时观察到，转染miR378e、miR486-3p、siGOLPH3L、siMYO18A后，受照细胞的存活率降低。
　　结论：
　　1.γ射线照射后，细胞高尔基体出现弥散现象，且具有一定的剂量效应和时间效应。
　　2.高尔基体的弥散现象与细胞周期G2/M期阻滞相关，但在辐射损伤中的高尔基弥散与周期阻滞没有因果关系。
　　3.高尔基体的弥散与细胞所受损伤程度相关，辐射防药物VND3207能抑制弥散。
　　4. DNA-PKcs抑制剂NU7441抑制了DNA损伤的修复，也抑制了高尔基体弥散。
　　5.高尔基体蛋白 GOLPH3，在照射后表达下调，可被 DNA-PKcs敲低抑制下调。
　　6. miRNA分子miR-378e、miR-486-3p在高尔基体弥散中起一定作用。

目录

声明

英文缩略词表

引言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

一、 放射损伤致高尔基体形态变化

二、 Nocodazole诱发高尔基体弥散与细胞周期阻滞

三、 辐射防护药物VND3207对高尔基体弥散的影响

四、DNA-PKcs抑制剂NU7441对高尔基体弥散的影响

五、放射损伤中高尔基体蛋白GOLPH3表达变化

六、放射损伤诱发的高尔基体弥散相关miRNA

七、GOLPH3L和MYO18A对高尔基体弥散和细胞存活的影响

讨论

结论

参考文献

附 录 Ⅰ个人简历

致谢

综述:高尔基体蛋白GPLPH3功能的研究