M2型巨噬细胞在小肠放射损伤修复中的作用和机制研究

摘要

放射治疗是当今肿瘤治疗的三大手段之一，在病人术前或是术后放疗可以有效治愈肿瘤，减少肿瘤复发概率。但是腹部和盆腔肿瘤在放射治疗过程中，放射性肠损伤是一重要的临床问题。放射性肠损伤是由于肠上皮放射敏感性较高，受照小肠或是结直肠损伤诱发的肠道反应，常常会出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻和营养吸收障碍，体重下降，甚至出现便血、肠梗阻、肠篓等病变，严重影响病人的生活质量，不利于放疗对腹盆腔肿瘤的控制。
　　哺乳类动物肠上皮是由单层柱状上皮组成，主要分为两个不同部分：分化区和增生区，分化的上皮细胞主要存在于绒毛和上皮表面，增生上皮细胞主要位于隐窝，可以进一步的分为干细胞和TA细胞，TA细胞具有快速分化并转移到增生区，干细胞又能及时补充TA细胞，因此在增生区连续不断地分化会导致上皮细胞沿隐窝-绒毛轴方向移动，逐渐移动到分化区，并使上皮细胞分化为吸收细胞系（肠细胞）和分泌细胞系（杯状细胞和内分泌细胞）。所以认为肠上皮是由四种肠道上皮细胞系组成，它们都起源于干细胞，并且位于隐窝基底部的干细胞在维持肠上皮平衡起到重要作用1-2。像是肠道感染、放射损伤和特发性肠炎等各种各样疾病引起的肠上皮损伤就会造成上皮细胞的凋亡、上皮屏障的破坏3。上皮层受到损伤，就会逐步激活再生程序，隐窝干细胞增殖，并移动到分化区，使上皮层恢复连续紧密的结构4。那么分化区凋亡的上皮距离隐窝干细胞甚远，如何及时通知到干细胞呢？巨噬细胞是固有免疫系统的组成部分，在体内最大的巨噬细胞群之一就是肠道巨噬细胞5，它们位于上皮屏障下方，参与肠道的免疫应答，但目前原代培养存在困难。Tanja等认为巨噬细胞这种免疫应答激活不仅仅是由于外来物质的刺激，还有上皮参与，所以他们进行了巨噬细胞与上皮细胞的共培养，但是在共培养的第7天发现只有少量巨噬细胞存活; Hiroki等人研究巨噬细胞与上皮细胞之间相互传递信号的机制，试通过体外培养Caco-2与THP-1，并没有首选体内肠巨噬细胞。
　　成熟的巨噬细胞在主要是来源于骨髓，随着外周血液循环到达组织，组织的微环境可使巨噬细胞发生极化。目前巨噬细胞极化类型主要分为两种：M1型主要是参与免疫应答，吞噬有害微生物等，产生炎症因子IL-6、NO等，提高机体的防御，抵御有害物质侵袭；M2型主要是在损伤组织中通过分泌抗炎因子参与修复与重塑，减轻机体炎症反应。
　　鉴于此，本论文首先对肠道自身的巨噬细胞进行了极型鉴定，在体外模拟凋亡肠道上皮细胞诱导Raw264.7细胞极化，探索这种巨噬细胞对隐窝肠道干细胞的作用和机制，为放射损伤的小肠修复提供理论依据。
　　一、小鼠小肠内巨噬细胞极型和在放射损伤中的作用
　　目的：肠道巨噬细胞在放射损伤中的作用
　　方法：通过对对照组和2Gy、8Gy照射组照后72小时和96小时C57BL/6小鼠肠细胞的分离及利用流式细胞分选技术，得到小鼠肠道巨噬细胞；对小鼠肠道巨噬细胞抽提RNA，以IL-10和iNOS基因作为分型标志物，进行实时荧光定量PCR检测，以确定照射前后巨噬细胞极型；正常C57BL/6小鼠在第1天、5天、7天和9天分别经腹腔注射200μl Clodronate脂质体、PBS脂质体部分祛除小鼠肠道巨噬细胞，第8天和第11天进行流式细胞术分析小鼠胸腺、淋巴、肠道、脾脏、骨髓CD68+细胞选取最佳祛除巨噬细胞的时间点；对照组与照射组小鼠均分别给予Clodronate脂质体和PBS脂质体，第8天小鼠进行8Gy的全身照射并在照后72小时、96小时采肠道标本，进行 CD68、Claudin5免疫组织化学染色、HE染色、肠上皮核间距分析观察小鼠肠道的放射损伤情况。
　　结果：对照组小鼠肠道巨噬细胞百分数是59.2％、60.6%、60.3%，2Gy照后72小时细胞百分数25.8%、33.7%、30.8%，巨噬细胞开始下降；96小时细胞百分数49.9%、44%、42.1%，逐渐恢复；8Gy照后72小时细胞百分数40.9%、36%、42.9%，96小时细胞百分数40.2%、40.5%、39.3%，未见明显恢复；RT-PCR结果表明对照组和照射组小鼠肠道的巨噬细胞均存在M2型巨噬细胞；小鼠腹腔注射 Clodronate脂质体和PBS，发现小鼠体内胸腺、淋巴、肠道、脾脏、骨髓细胞巨噬细胞在给药后的第8天CD68阳性细胞数量开始下降，在第11天进一步下降，后期恢复到第8天水平，因此选取给药后第11天作为祛除小鼠体内巨噬细胞效果最佳时间点；病理分析显示在给予小鼠8Gy照射后，巨噬细胞减少的小鼠肠道损伤较对照组更为明显；核间距分析结果表明8Gy照射后72h对照组上皮细胞核排列较对照组排列较为紊乱，Clodronate脂质体组上皮细胞核排列更加紊乱，核间距增大，出现核固缩坏死；96h对照组上皮逐渐开始恢复，增生，核排列较72 h紧密，形态相对完整，96hClodronate脂质体组上皮损伤更为严重，核间距进一步增加；Claudin5结果显示8Gy照射后72h对照组与Clodronate脂质体组均存在部分屏障损伤，未见明显差异，96h对照组部分损伤，Clodronate脂质体组肠道组织大体存在明显损伤，其损伤程度明显高于对照组。
　　结论：在小鼠肠道内巨噬细胞是以M2型存在，而且在照射后极型不改变，并在肠道放射性损伤中起保护作用。
　　二、体外诱导M2巨噬细胞促进Lgr5肠道干细胞增殖
　　目的：肠道巨噬细胞发挥作用的机制
　　方法：对 CT26小鼠结肠癌细胞进行6Gy和15Gy照射并用流式细胞仪通过磷脂酰丝氨酸外翻法检测细胞凋亡；用凋亡细胞上清液对RAW264.7小鼠巨噬细胞细胞进行体外极化诱导分型，通过Elisa分析IL-10与IL-12的变化确定细胞体外极化诱导后的极型；利用Lgr5-EGFP-IRES-creERT2小鼠进行Lgr5肠道干细胞的分离与培养；将体外诱导极化的RAW264.7巨噬细胞与 Lgr5肠道干细胞进行细胞共培养或Transwell培养，通过多功能酶标仪检测GFP荧光强度。
　　结果： CT26细胞在15Gy照射条件下在72小时凋亡细胞率达到66.9%；RAW264.7细胞在凋亡上清液的作用三天后细胞IL-10表达上调以及IL-12表达下调，证实RAW264.7发生极化成为M2型巨噬细胞；Lgr5+肠道干细胞在分别缺少Noggin、EGF、R-spondin干细胞生长因子的条件下与对照组RAW264.7、M2型RAW264.7分别共培养，表明M2型巨噬细胞可以分泌EGF因子，代替培养基中的EGF，促进干细胞的生长增殖。
　　结论： M2型巨噬细胞通过分泌EGF促进Lgr5+肠道隐窝干细胞的生长增殖。
　　综上所述表明肠道中存在M2型巨噬细胞，这种极型不因照射而改变，并且通过分泌EGF因子，促进肠道隐窝干细胞Lgr5生长增殖。肠道中M2型巨噬细胞的缺失会导致肠道放射损伤修复的延缓。

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引言

第一部分 小鼠小肠内巨噬细胞极型和在放射损伤中的作用

材料方法

结果

讨论

第二部分 体外诱导M2巨噬细胞促进Lgr5肠道干细胞增殖

材料和方法

结果

讨论

结论与展望

结论

展望

综述: 巨噬细胞的极化与作用

参考文献

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