耐碳青霉烯类抗生素铜绿假单胞菌MexAB-OprM和OprD2的表达水平研究

摘要

一、课题背景: 铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)属于革兰阴性杆菌假单胞菌属，广泛分布于自然界，是临床常见的条件致病菌，其感染在各种恶性肿瘤、免疫功能低下患者尤其严重．近年来，由于其高分离率、高耐药率、高病死率及在临床上时有爆发流行而引起广泛关注．PA的耐药性分为固有性和获得性耐药，且其耐药性日益严重，而临床可用于治疗PA感染的抗菌药物却极为有限．碳青霉烯类抗生素是一类高效广谱的β内酰胺类抗生素，对革兰阳性菌、革兰阴性菌、需氧菌、厌氧菌均有较强的抗菌活性，其最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)非常接近，且对革兰阴性菌有一定的抗生素后效应(PAE)，对大多数β—内酰胺酶包括超广谱β—内酰胺酶(ESBLs)稳定，与第3代头孢菌素无交叉耐药性，故在临床上成为治疗多重耐药PA感染的重要抗菌药物．然而近几年，随着碳青霉烯类抗生素的广泛应用，PA耐药菌株急剧增加，2005年中国临床分离PA对美罗培南和亚胺培南的耐药率已分别达到32.1％和31.3％，给临床抗感染治疗带来了极大困难．研究PA对碳青霉烯类抗生素的耐药机制，有助于新药的研制，可以帮助临床医师制定合理的给药方案，提高PA感染的疗效，防止耐药菌株的产生和播散． 已知药物外排泵在许多细菌中存在，分为ATP水解能驱动型外排泵和跨膜质子梯度能驱动型外排泵，后者包括主要易化超家族(MFS)、多药和毒性化合物外排家族(MATE)、小多药耐药家族(SMR)和耐药小结节细胞分裂家族(RND)．其中RND型外排泵在革兰阴性菌包括PA的耐药中发挥着越来越重要的作用．已证实的PARND型外排泵有：MexAB-OprM、MexCD—OprJ、MexEF—OprN、MexXY—OprM、MexJK—OprM和MexGHI—OpmD，它们均为三组分结构，包括内膜转运蛋白(MexB，D，F，Y，K，I)、内膜相关质膜融合蛋白(MexA，C，E，X，J，H)和外排通道蛋白(OprM，J，N，OpmD)．其中MexAB-OprM和MexXY—OprM在PA的固有性耐药中起着重要的作用，MexXY—OprM主要介导PA对氨基糖苷类抗生素的固有性耐药，目前研究认为美罗培南不经特殊通道扩散，PA对美罗培南耐药的主要原因是MexAB-OprM外排泵的过度表达，它能够将已经进入菌体的美罗培南转运出菌体胞质，从而使得药物在菌体胞质的累积率下降，而造成对美罗培南的耐药，甚至是高度耐药． PA外膜上有多种外膜蛋白，可形成小孔通道，抗菌药物经这些外膜通道进入细菌，如果这些通道改变或缺失，抗菌药物将不能进入细菌到达作用靶位．外膜蛋白OprD2孔道是小分子亚胺培南选择性快速进入菌体的特异性通道，且国外已有研究证明PA对亚胺培南的耐药与青霉素结合蛋白的改变基本无关．OprD2是目前所知的PA外膜中唯一有助于抗生素通透的孔道蛋白，能形成亚胺培南的特异性结合位点，当OprD2减少或丢失时可导致PA对亚胺培南耐药．所以目前认为外膜蛋白OprD2的丢失或含量减少是PA对亚胺培南耐药的主要机制之一． 综上所述，携带外膜通道蛋白OprD2基因缺失或多药外排泵的过表达是导致PA对碳青霉烯类抗生素耐药的重要原因，特别是外排泵的发现从根本上改变了对PA多重耐药机制的认识，也使我们意识到泵介导多重耐药的重要性．因此收集了我国临床分离的655株PA，并研究了其对亚胺培南和美罗培南的耐药性及外排泵抑制剂(efflux pump inhibitor，EPI)CCCP对其耐药性的影响，采用实时荧光定量PCR方法(Real—timeRT—qPCR)研究我国临床分离的PA菌株对碳青霉烯类抗生素的耐药性与MexAB-OprM和OprD2的相关性． 二、材料与方法: 收集我国临床分离的PA655株，琼脂稀释法测定PA加入外排泵抑制剂前后对亚胺培南和美罗培南的MIC；Real—timeRT—qPCR检测外排泵MexAB-OprM和孔蛋白OprD2的表达水平；SDS-PAGE和Western—blot检测外膜孔蛋白OprD2．结果采用x2检验法和方差分析法统计． 三、结果: 收集到的655株PA菌株对亚胺培南和美罗培南的不敏感率分别为47.48％和40.76％，加入外排泵抑制剂前后并无明显变化；52.04％(51/98)美罗培南耐药株MexAB-OprM显著高表达，明显高于敏感菌株(P＜0.05)，43.70％(59/135)亚胺培南耐药株OprD2显著低表达，14.81％(20/135)亚胺培南耐药株OprD2表达缺失，明显低于敏感菌株(P＜0.05)；SDS-PAGE和Western—blot显示与标准菌株PAO1相比，OprD2表达水平减低菌株ZZ20显影减低，表达缺失菌株BJ1不显影，二者结果基本一致． 四、结论: PA对以亚胺培南和美罗培南为代表的碳氢霉烯类抗生素的耐药在我国部分省市极其严重，这可能和抗生素的使用及院内感染控制等有关．本研究表明MexAB-OprM表达升高和OprD2表达降低甚至缺失分别是我国PA对美罗培南和亚胺培南耐药的重要机制．

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综述 多重耐药铜绿假单胞菌的主动外排放制