人卵巢癌细胞系SK-OV-3中肿瘤干/祖样细胞的研究

摘要

目的:
　　 肿瘤干/祖样细胞的分离及鉴定是肿瘤干/祖细胞研究领域中的关键性问题之一。本课题通过球形体形成法对人卵巢癌细胞系SK-OV-3中肿瘤干/祖样细胞进行分离、培养扩增,并对其干/祖样细胞的特性进行鉴定,为研究卵巢癌发病机理及治疗奠定基础。
　　 方法:
　　 1.球形体形成法分离人卵巢癌细胞系SK-OV-3中肿瘤干/祖样细胞。
　　 2.将以球形体形成法筛选出的球形体形成细胞于CM与S6M交替更换培养基观察其多向分化和自我更新的潜能。
　　 3.双层软琼脂集落形成实验软琼脂培养检测球形体形成细胞的非依赖性锚定生长能力。
　　 4.通过PI染色利用FCM观察球形体形成细胞的细胞周期分布特点。
　　 5.检测球形体形成细胞在10μg/mlDDP作用下的凋亡率,分析其对DDP的抵抗作用。
　　 6.流式细胞仪检测球形体形成细胞中SP细胞及ALDH+细胞的比例。
　　 7.实时荧光定量PCR检测球形体形成细胞中干/祖细胞基因Oct4、Nanog的表达情况。
　　 8.球形体形成细胞裸鼠体内致瘤性的检测。
　　 结果:
　　 1.人卵巢癌细胞系SK-0V-3细胞中的极少部分肿瘤干/祖样细胞可在无血清特殊生长培养基中以球形体样悬浮长并长期培养、扩增并可连续传代50代以上。
　　 2.球形体形成细胞可在CM中贴壁生长,再更换为SGM后,有极少部分细胞以球形体样悬浮。
　　 3.球形体形成细胞具有强锚定非依赖性生长能力,在双层软琼脂培养基中可呈克隆样生长,克隆形成率为6.83％,显著高于SK-OV-3细胞的克隆形成率0.41％。
　　 4.细胞周期结果表明:球形体形成细胞中处于G0/G1期的细胞高于SK-OV-3细胞。
　　 5.球形体形成细胞在10μg/mlDDP作用后的0、12、24、36小时的凋亡率依次为0.30％％、2.64％、3.13％、11.05％,而SK-OV-3细胞在同浓度DDP作用后的0、12、24、36小时的凋亡率依次为4.95％、9.59％、29.77％、44.23％,球形体形成细胞的有较强的对于DDP的抵抗性。
　　 6.流式细胞仪检测结果证实:球形体形成细胞中SP细胞(8.7％)、ALDH+细胞(25.05％)均高于SK-OV-3中SP细胞(0.6％)、ALDH+细胞(8.00％)的比例。
　　 7.通过实时荧光定量检测表明:球形体形成细胞中干/祖细胞基因Oct4、Nanog的表达较SK-OV-3细胞分别上调8.8925倍、9.8783倍。
　　 8.裸鼠移植试验还证实了球形体形成细胞的致瘤性比SK-OV-3细胞强100倍。
　　 结论:
　　 利用球形体形成法从人卵巢癌细胞系SK-OV-3中分离纯化出的球形体形成细胞在体外具有干/祖细胞的自我更新、无限增殖、多向分化、对DDP的抵抗性的特点及SP细胞和ALDH+细胞比例较高、干/祖细胞基因Oct4、Nanog上调,在裸鼠体内证实具有高致瘤性,初步表明这些球形体形成细胞具有肿瘤干/祖细胞的特性。