通过质粒分子育种培育高效降解除草剂阿特拉津的细菌菌株

摘要

阿特拉津(atrazine)，化学名2-氯--4--乙胺基--6--异丙胺基-1，3，5-三嗪，商品名莠去津，是一种在世界范围内广泛使用的三嗪类除草剂，主要用于玉米、高粱、柑橘、甘蔗地的杂草防除。近40年来，由于阿特拉津的大量生产和使用，已经造成世界范围的土壤、地表水和地下水的严重污染。阿特拉津残留量过高时，不仅会影响轮作作物的生长，还会威胁人体健康。研究表明，阿特拉津是一种内分泌干扰剂，它能干扰激素调节功能，长期接触会导致人和动物卵巢癌、乳腺癌和白血病的发生，引起人和两栖动物的生殖缺陷和体重减轻。因此，阿特拉津的生物降解和污染环境的生物修复研究对生态安全和人类健康具有重要意义。 本研究通过富集培养从阿特拉津农药厂的废水和污泥中得到降解阿特拉津的混合菌群，它能以阿特拉津为唯一氮源生长，生长速度快，但不能彻底地降解阿特拉津，只能将阿特拉津降解为氰尿酸。我们以模式菌株假单胞菌ADP为供体，与混合菌群共同培养，通过质粒分子育种培育并筛选出两株高效、快速、彻底降解阿特拉津的菌株，分别命名NAD3和AD25。通过16S rRNA基因序列分析，它们与Arthrobacter和Micrococcus的同源性都在99％以上，结合Biolog分类鉴定结果，确定AD3菌株为藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，AD25菌株属于节杆菌属(Arthrobacter sp．)。 AD3和AD25菌株能以蔗糖或柠檬酸钠为碳源，阿特拉津为唯一氮源生长，降解速率和降解率都大大好于ADP菌株，可以将培养基中500 mg/L的阿特拉津在72 h内降解95％以上，并保持菌体较高的生长量。通过温度、pH值和阿特拉津浓度对菌体生长的影响实验，确定AD3和AD25菌株的最适生长条件为：阿特拉津浓度为500 mg/L，pH 7．0，30℃。但氰尿酸积累实验发现，AD25菌株生长后期在培养基中有少量氰尿酸积累，而混合菌群在培养基中氰尿酸不断形成积累。 斑点杂交和PCR分析表明，AD3和AD25菌株基因组中没有atzA基因，它们都含有trzN、atzB、atzC和atzDEF基因。AD25菌株中的trzN基因与Arthrobacter aurescens TCl菌株中的trzN基因的同源性为99％，atzB、atzC和atzEF基因与ADP菌株中相应的基因同源性为99％-100％。AD25菌株中的atzD基因的全基因序列与ADP菌株中的atzD基因同源性为99％，其中一个核苷酸发生了变化，导致编码的蛋白中一个氨基酸发生改变。质粒分析发现，AD25菌株和ADP菌株中含有一个相同大小的质粒，Southern杂交结果表明，atzD基因位于质粒上，说明接合体菌株AD25获得了atzD基因，并且ADP菌株中的阿特拉津降解质粒pADP-1接合转移到了AD25菌株中。trzN基因位于细菌的染色体上。对AD25菌株的氰尿酸酰胺水解酶AtzD进行了表达纯化和酶学性质鉴定，发现AD25菌株的AtzD纯酶酶反应的最适pH为7.8，在pH 7.0和7.4的中性环境中比较稳定，对37℃的耐受能力较强。Cu<'2+>和Zn<'2+>对酶有激活作用，Fe<'2+>、Ca<'2+>和EDTA对酶有一定的抑制作用，Mg<'2+>对酶几乎没有影响，Co<'2+>和Ni<'2+>对酶有很强的抑制作用。AD25菌株的AtzD对氰尿酸的K<,m>为308.8±20μmol·L<'-1>，V<,max>为49.8±10μmol·L<'-1>min<'-1>，而ADP菌株的AtzD的K<,m>为31.5±10 μmol·L<'-1>，V<,max>为345±10μmol·L<'-1>min<'-1>。AD25菌株的氰尿酸酰胺水解酶的反应速度要比ADP菌株的慢十倍，说明AD25菌株的AtzD在底物浓度较高时才能进行酶反应，酶与底物的结合能力差，而ADP菌株的氰尿酸酰胺水解酶在底物浓度较低的情况下就可以催化酶反应进行，酶与底物的结合能力强，酶反应速度快。推测AD25菌株的氰尿酸酰胺水解酶活力低是由于其基因和酶发生突变造成的。 用浓度为14％的聚乙烯醇(PVA)包埋的AD3菌株细胞在阿特拉津含量为500mg/L、pH 7.0、30℃下降解速度和降解率都比游离菌高，并且对温度、pH值和底物浓度适应能力更强，在温度为15℃，或pH为5.0，或阿特拉滓浓度为1000mg/L的不利条件下，阿特拉津降解率仍能达到90％以上。固定化细菌具有良好的机械强度和重复使用稳定性，连续进行30批次实验以后，固定化小块的物理性状和阿特拉津降解能力没有明显变化，表明固定化的AD3菌株在阿特拉津废水处理中有很好的应用潜力。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章阿特拉津生物降解研究综述

1.1阿特拉滓的生态风险

1.2阿特拉津的微生物降解

1.3细菌的阿特拉津降解途径和降解质粒

1.4阿特拉津污染的生物修复

1.5假单胞菌ADP菌株的阿特拉滓降解

1.6节杆菌TC1菌株的阿特拉津降解

1.7南开大学生物降解实验室的阿特拉津生物降解研究

1.8立题依据和主要研究内容

参考文献

第二章高效阿特拉津降解菌株的质粒分子育种和菌株鉴定

2.1前言

2.2材料与方法

2.3结果与讨论

2.3.1接合体菌株AD3和AD25的获得

2.3.2 16S rRNA基因鉴定

2.3.3细菌的Biolog分类鉴定

2.3.4电子显微镜观察

2.4本章小结

参考文献

第三章AD3和AD25菌株的阿特拉津降解特性

3.1前言

3.2材料与方法

3.3结果与讨论

3.3.1温度对菌株生长的影响

3.3.2 pH对菌株生长的影响

3.3.3阿特拉津浓度对菌株生长的影响

3.3.4生长和降解曲线测定

3.3.5阿特拉津降解中间产物氰尿酸的测定

3.4本章小结

参考文献

第四章AD3和AD25菌株的降解基因和质粒分析

4.1前言

4.2材料与方法

4.3结果与讨论

4.3.1阿特拉津降解基因的DNA斑点杂交

4.3.2降解基因的PCR检测

4.3.3降解质粒检测和降解基因定位

4.4本章小结

参考文献

第五章AD25菌株的atzD基因的克隆、表达和酶鉴定

5.1前言

5.2材料与方法

5.3结果与讨论

5.3.1高效表达载体的构建

5.3.2蛋白表达体系的建立

5.3.3氰尿酸酰胺水解酶活力测定方法的建立

5.3.4 AtzD粗酶液保存条件的优化

5.3.5 AtzD蛋白的纯化

5.3.6 AtzD蛋白的酶学性质

5.4本章小结

参考文献

第六章AD3菌株的固定化和降解特性研究

6.1前言

6.2材料与方法

6.3结果与讨论

6.3.1不同PVA浓度对固定化效果的影响

6.3.2游离菌和固定化菌的阿特拉津生物降解比较

6.3.3温度对游离菌和固定化菌阿特拉津降解的影响

6.3.4 pH值对游离菌和固定化菌降解阿特拉津的影响

6.3.5阿特拉津浓度对游离菌和固定化菌阿特拉津降解的影响

6.3.6固定化菌重复使用的稳定性

6.4本章小结

参考文献

第七章结论、创新点和建议

7.1结论

7.2创新点

7.3对今后研究工作的建议

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

发表论文1

发表论文2

发表论文3