牦牛基因组微卫星挖掘与筛选验证

摘要

牦牛（ Bos grunnines），属哺乳纲（ Mammalia）偶蹄目（ Artiodactyla）牛科（ Bovidae）牛属（ Bos），牦牛染色体核型为2n=60，基因组中共包含2,645.15 Mb碱基信息。本研究在已公布的野生牦牛基因组测序基础上做了以下实验：对野生牦牛基因组部分微卫星序列特征进行分析与统计；以麦洼牦牛为样本筛选多态性微卫星标记；利用成功筛选的微卫星标记对麦洼牦牛现有群体遗传多样性和种群遗传结构进行了研究。主要研究结果如下：
　　1.牦牛基因组微卫星重复序列特征分析
　　通过对野牦牛部分基因组，即251540707 bp(占全基因组的9.51％)的序列进行微卫星序列搜索，共找到43409个微卫星重复序列位点，根据结构分析发现连续型微卫星位点的数量有42063个，占到总数的96.734%，间断型微卫星位点数量（1009个）占总数的2.320%，复合型微卫星位点最少(411个)，仅占总数的0.945%；根据重复单元分为二碱基重复、三碱基重复、四碱基重复、五碱基重复。分析发现，在野牦牛基因组中五碱基的总量最多，为16787个，占总量的38.59%；其次二碱基的总数量是12377个，占28.45%；三碱基的数量为9466个，占21.76%；最后是四碱基和六碱基，六碱基的含量最少，仅占总量的2.33%。紧接着又对连续型的各重复单元进行细致分析， AC(AC/CA/TG/GT)、 AGC(TCG)、AAAT(TTTA)、ACTGA（ TGACT）、TGAAAG(ACTTTC)分别是在二碱基重复、三碱基重复、四碱基重复、五碱基重复、六碱基重复类型中含量最高的微卫星重复，分别占其对应总量的60.15%、31.04%、18.36%、19.36%和11.05%。
　　2.利用麦洼牦牛筛选验证从基因组获得的微卫星
　　从基因组获得的微卫星序列中筛选出适合引物设计的序列，在其核心序列的两侧翼上设计引物，然后利用麦洼牦牛基因组 DNA为模板进行微卫星位点扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测筛选具有多态性的微卫星标记。在本研究中，共设计了470对微卫星引物，共成功筛选了77对微卫星引物，其中包含35个二碱基重复位点、15个三碱基重复位点、15个四碱基重复位点、12个五碱基重复位点，筛选成功比率分别为46.1%、31.9%、33.3%、30%。挑选出具有多态性的微卫星位点的样本送出测序，其结果验证了实验的正确性。
　　3.麦洼牦牛微卫星位点的遗传结构和群体分析
　　实验筛选出的77对引物，分别对191个麦洼牦牛基因组 DNA样本进行位点扩增，通过使用聚丙烯酰胺凝胶实验或毛细管电泳实验对琼脂糖效果明显的个体进行基因分型，得到的基因型数据通过Cervus3.0和 Genepop4.2软件进行位点多态性分析，并使用 Structure3.0软件对麦洼牦牛群体遗传分化特征进行分析。二碱基、三碱基、四碱基、五碱基微卫星位点的平均等位基因位点数(N)分别为10.943、9.267、4.2、2.75个，平均观测杂合度(Ho)分别为0.7346、0.5041、0.4191、0.3830，平均期望杂合度(He)分别为0.7921、0.8152、0.5814、0.4501，平均多态位点含量(PIC)分别为0.7617、0.7831、0.5130、0.3652。大部分的微卫星标记具有高度多态性(40个， PIC>0.5)，中度多态性有28个(0.25

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1 文献综述

1.1 微卫星分子标记概述及其应用

1.1.1 微卫星 DNA 的发现与命名

1.1.2 微卫星序列的发生原理及分类

1.1.3 微卫星的分布和含量

1.1.4 微卫星序列获取方法

1.1.5 微卫星 DNA 技术在各动物中的应用

1.2 牦牛的基本概况及其研究现状

1.2.1 牦牛的基本概况

1.2.2 牦牛遗传多样性和微卫星标记研究现状

2 牦牛基因组微卫星重复序列特征分析

2.1 材料与方法

2.1.1 牦牛全基因组信息的获取

2.1.2 方法

2.1.3 基因组微卫星重复序列特征分析

2.2 结果

2.2.1 对牦牛基因组微卫星序列总体分析

2.2.2 对牦牛基因组微卫星序列各重复类型数据的进一步分析

2.3 讨论

2.3.1 基于牦牛基因组微卫星序列总体的讨论

2.3.2 牦牛基因组微卫星各连续型优势重复单元的碱基组成

2.3.3 牦牛基因组微卫星的“其他”信息

3 麦洼牦牛微卫星位点的筛选验证

3.1 材料

3.1.1 实验动物及样品的采集

3.1.2 主要仪器设备

3.1.3 主要工具酶及试剂

3.1.4 试剂配制

3.2 方法

3.2.1 麦洼牦牛基因组 DNA 的提取

3.2.2 微卫星位点的筛选及其引物的设计

3.2.3 麦洼牦牛微卫星位点的扩增

3.2.4 琼脂糖凝胶电泳

3.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.2.6 数据处理

3.3 结果与分析

3.3.1 麦洼牦牛全基因组样本提取的琼脂糖凝胶电泳检测

3.3.2 麦洼牦牛微卫星位点的扩增和电泳图谱

3.3.3 麦洼牦牛微卫星位点的聚丙烯酰胺凝胶电泳分型

3.3.4 麦洼牦牛微卫星位点的验证

3.3.5 麦洼牦牛微卫星位点的筛选情况

3.4 讨论

3.4.1 基于基因组微卫星标记的高效性

3.4.2 微卫星中影子带

3.4.3 基因组微卫星标记筛选的难度

4 麦洼牦牛微卫星位点的遗传结构和群体分析

4.1 材料

4.1.1 动物及样品的采集

4.1.2 主要仪器设备和试剂

4.2 方法

4.2.1 麦洼牦牛基因组 DNA 的提取及检测

4.2.2 麦洼牦牛微卫星位点的聚丙烯酰胺凝胶电泳分型

4.2.3 生物信息学分析方法

4.3 结果与分析

4.3.1 麦洼牦牛基因组 DNA 的提取及检测

4.3.2 麦洼牦牛微卫星位点的聚丙烯琼脂糖凝胶电泳分型

4.3.3 麦洼牦牛微卫星多态性分析

4.3.4 麦洼牦牛微卫星遗传结构和群体分析

4.4 讨论

4.4.1 麦洼牦牛自然群体微卫星多态性特征

4.4.2 麦洼牦牛自然群体的遗传结构结构和群体分析

结论

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的与学位论文内容相关的学术论文及研究成果