细菌对磺胺类药物耐药基因三重PCR检测试剂盒研制与应用

摘要

为了建立特异、灵敏、快速的细菌磺胺类药物耐药基因检测技术，指导临床用药，为控制耐药菌株的传播提供有力的手段，本研究根据GenBank提供的序列，分别设计了针对Sul1、Sul 2和Sul3三个基因的3对特异性引物，利用三重PCR技术研制了细菌磺胺类药物耐药基因的检测试剂盒，并进行了初步应用。 利用单基因PCR扩增技术，筛选出阳性扩增菌株FJ504，扩增产物纯化测序后与GenBank上公布的Sul基因序列进行同源性比较，其同源性均达到98％以上。以FJ504为PCR检测试剂盒的阳性对照，药敏质控菌ATCC25922为阴性对照，探索三重PCR反应条件，并对反应体系进行了优化，筛选了最佳的Mg<'2+>浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度和引物浓度，选定了最适的退火温度和循环次数，并建立了快速灵敏的模板制备方法。优化后的反应体系和反应参数为：反应总体积为50 μL，其中10×PCRbuffer 5 μL,MgCl<,2>(25 mmol/L)5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4μL，Sul基因、Sul2基因和Sul3基因的特异性上下游引物(25μmol/L)分别1.4 μL、0.4 μL、1.2μL，Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL)0.35 μL，模板5μL；反应参数：预变性94℃5 min，变性94℃50 s，退火55℃45 s，延伸72℃50 s，32个循环，72℃终止延伸6 min。 在三重PCR反应体系优化完成的基础上，组装了三重PCR检测试剂盒，并对已测序鉴定的阳性菌株进行扩增，均可扩增到特异性条带；而对大肠杆菌标准菌株、葡萄球菌标准菌株、鸡传染性支气管炎病病毒(IBV)、兔瘟病毒的核酸样品等对照样品扩增，PCR结果均为阴性，说明该试剂盒特异性强。用试剂盒检测不同稀释度的阳性样品，其检测灵敏度可达到2×10<'4>cfu/mL，说明该试剂盒灵敏性高。试剂盒批间和批内重复性试验结果表明，该试剂盒具有良好的重复性。同时，本试剂盒在含引物但不含Taq酶的情况下可4℃保存四个月，-20℃条件下保存五个月。 对50株随机选取的菌株，同时进行药敏试验和试剂盒检测，结果显示，本试剂盒与常规药敏试验的符合率可达90％。同时，本试剂盒还具有反映细菌的隐性耐药性的优势。 利用本试剂盒对来源于我国24个省(市)约730株细菌(规模化猪、鸡场大肠杆菌和沙门氏菌，四川地区牦牛、奶牛、兔以及野生动物肠道分离菌)进行了检测，结果表明，不同来源动物、不同年代以及不同种属的动物源细菌磺胺类药物耐药基因分布存在很大的差异，猪、鸡源细菌的检出率分别高达79.2％和77.1％，而牦牛和野生动物源细菌的检出率则分别只有36.4％和20.8％；大肠杆菌、沙门氏菌和葡萄球菌，其sul基因的检出率分别达到83.2％、68.O％和73.8％。在70年代，大肠杆菌sul基因的检出率仅有30.0％，而到2004年以后，其sul基因的检出率却高达70.9％，增加了近1.5倍。由此可见，本试剂盒能准确检测动物源细菌对磺胺类药物的耐药性，反映出耐药基因的检出率呈不断上升的趋势。本研究研制的多重PCR检测试剂盒具有灵敏、特异、快速的优点，为我国动物源细菌磺胺类药物耐药基因的检测及流行病学调查提供了新的技术手段，在国内尚属首次报道。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1耐药性的产生及其检测方法研究进展

1.1.1细菌耐药现状概述

1.1.2耐药性检测方法研究进展

1.2 PCR耐药性检测试剂盒的研究

1.3细菌对磺胺类药物的耐药情况

1.3.1磺胺类药物的性质及其作用机理

1.3.2细菌对磺胺类药的耐药机制

1.3.3细菌对磺胺类药的耐药现状

1.4磺胺类药物耐药基因及扩增目的基因的选择

1.5本研究的前期工作基础

1.6存在的问题及本研究的创新点

1.7本研究的技术路线

2.试验材料

2.1试验菌株：

2.2试验试剂

2.3主要仪器

3.试验方法

3.1样品的采集：

3.2细菌分离、纯化及鉴定

3.3三重PCR反应引物设计

3.4试剂盒阳性对照的制备

3.4.1单基因PCR扩增模板制备

3.4.2单基因PCR扩增及阳性菌株的筛选

3.4.3 PCR阳性扩增产物纯化、回收

3.4.4核酸序列测定及同源性分析

3.5三重PCR基本模式的建立

3.6三重PCR反应体系的优化

3.6.1 PCR反应各组分浓度的优化

3.6.2 PCR反应参数的优化

3.7模板制备方法的筛选及优化

3.7.1模板制备方法的筛选

3.7.2模板制备选定方法的优化

3.8试剂盒操作方法的建立

3.9试剂盒敏感性试验

3.10试剂盒特异性试验

3.11试剂盒重复性试验

3.12试剂盒的保存期试验

3.13试剂盒的外包装和内容

3.14试剂盒的应用

3.14.1试剂盒检测与药敏试验比较

3.14.2对我国24个省的样品进行耐药性检测

3.15试剂盒操作规程(草案)拟定

4.试验结果与分析

4.1样品采集及细菌的分离纯化鉴定结果

4.2阳性对照的筛选及序列测定结果

4.2.1阳性菌株筛选结果

4.2.2阳性扩增序列测定结果及同源性分析

4.3三重PCR基本模式的建立结果

4.4三重PCR反应体系的优化结果

4.4.1 PCR反应各组分浓度的优化结果

4.4.2 PCR反应参数的优化结果

4.5样品模板制备方法的筛选和优化

4.5.1模板制备方法的筛选结果

4.5.2模板制备选定方法的优化结果

4.6试剂盒样品制备及三重PCR扩增方法的确立

4.6.1待检样品制备

4.6.3 PCR阴性对照及阳性对照

4.6.4 PCR检测结果判断

4.7试剂盒敏感性试验结果

4.8试剂盒特异性试验结果

4.9试剂盒重复性试验结果

4.9.1批内重复性

4.9.2批间重复性

4.10试剂盒保存期试验结果

4.11试剂盒的外包装和内容

4.12试剂盒的应用结果

4.12.1试剂盒与常规药敏试验比较

4.12.2对全国24个省的样品进行耐药性检测结果

4.14试剂盒操作规程(草案)的拟定结果

5.讨论

5.1磺胺类药物耐药基因三重PCR检测试剂盒的制备

5.1.1三重PCR检测试剂盒研制的必要性

5.1.2 PCR扩增目的基因的选择

5.1.3三重PCR检测试剂盒的性能

5.2关于多重引物设计原则

5.3关于PCR反应模板制备方法的筛选与优化

5.4关于多重PCR反应方法建立和优化的影响因素

5.5关于试剂盒敏感性的影响因素

5.6关于试剂盒重复性影响因素

5.7关于试剂盒的保存期的影响因素

5.8关于试剂盒的应用

6.结论

附录

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录