鸭瘟病毒UL33基因的克隆、原核表达、转录时相和细胞定位研究

摘要

论文对DPV UL33基因（GenBank登录号为EF643556）开展如下研究：DPV UL33基因序列分子特性分析、克隆、原核表达和抗体制备，基因在鸭胚成纤维细胞内的转录和表达产物细胞定位等。结果如下： 1．鸭瘟病毒UL33基因分子特征分析 DPV UL33基因大小为408bp，编码135aa。通过信号肽、跨膜区、磷酸化位点和疏水性进行分析预测，发现该基因编码的蛋白不存在跨膜区和信号肽结构，只含有8个潜在的磷酸化位点。并通过进化树分析发现该基因属于α-疱疹病毒属，并且与MDV、ILTV、HVT等禽类疱疹病毒的进化关系最近，与其他疱疹病毒关系则较远。 2．UL33基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备通过构建pET-32/UL33重组原核表达载体，利用IPTG进行诱导表达，得到大小为37kDa的重组融合蛋白，与预期表达的蛋白大小相一致，其主要是以包涵体的形式存在。最佳表达优化条件为37℃下加入0．2mmo/L IPTG诱导6h。兔抗UL33抗体IgG经辛酸-硫酸铵盐析和High-Q阴离子交换层析纯化，该方法具有高效、特异性强的优点。 3．DPV体外感染宿主细胞UL33基因蛋白细胞定位及转录时相分析 DPV感染宿主细胞后，用间接免疫荧光的方法检测到UL33编码的蛋白位于细胞胞核中。对其蛋白表达时相的动态分析结果为病毒感染2h后即可在细胞中检测到荧光，8h荧光量达到最大，之后逐渐降低。转录时相是通过荧光定量PCR用相对定量的方法检测该基因转录的情况。用SYBR GreenⅠ染料法检测各时间段收取的细胞样品检测到1h开始出现转录，8h达最高峰，32h下降至最低水平。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

声明

本论文的创新性研究工作

第一章 文献综述

1 疱疹病毒概述

2 鸭瘟概述

2.1 病原学概述

2.2 流行病学

2.3 临床症状

2.4 分子生物学概述

3 疱疹病毒UL33 基因的研究进展

3.1 疱疹病毒UL33 基因及其编码蛋白的特性

3.2 UL33 编码蛋白的功能

3.3.结语

4 UL33 基因在鸭瘟中的研究

5 实验的目的及意义

第二章 鸭瘟病毒UL33 基因T克隆及生物信息学分析

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1 DPV UL33 基因的初步判定

2.2 DPV UL33 基因的克隆、测序

3.讨论

3.1 UL33 基因的引物设计

3.2 生物信息学

3.3 序列生物信息学

3.4 蛋白质生物信息学

3.5 蛋白功能预测

第三章 鸭瘟病毒UL33 基因的原核表达及多克隆抗体的制备

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 实验结果

2.1 重组表达质粒pET-32/UL33 的构建

2.2 重组蛋白的诱导表达及条件优化

2.3 UL33 重组蛋白多克隆抗体琼扩结果

2.4 免疫印迹

2.5 抗体IgG的粗提和纯化

3 讨论

3.1 外源基因融合表达的意义

3.2 表达载体和宿主菌

3.3 诱导表达

3.4 抗血清的制备

第四章 鸭瘟病毒UL33 基因转录时相分析和蛋白细胞定位

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 试验方法

2 实验结果

2.1 转录时相

2.2 蛋白细胞定位

3 讨论

3.1 转录时相

3.2 蛋白细胞定位

结论

参考文献

致谢

作者简介以及攻读硕士学位期间发表的学术论文