有机磷农药-敌敌畏的发育生殖毒性及其机制的实验研究

摘要

目的：建立并确证有机磷农药的代表-敌敌畏诱导先天性尿道下裂的大鼠模型，探讨雄性哺乳动物先天性尿道下裂的病因，并研究广泛使用的有机磷农药具有的发育生殖毒性进行研究。 方法： (1)敌敌畏(DDVP)诱导雄性大鼠先天性尿道下裂模型的建立和确定：初孕清洁级大鼠40只随机分成4组：生理盐水对照组10只，敌敌畏高、中、低剂量组各10只。根据预实验指导，设敌敌畏5 mg／kg／d、1.25 mg／kg／d和0.625 mg／kg/d三个剂量组。各组孕大鼠均在孕11天～18天，每晨管喂相应药物1.5ml～2ml一次，共连续管喂8次；停药后待其孕20天(d20)的下午，从一侧股血管放血处死孕鼠，剖开子宫，剔除胎盘、脐带，在肉眼、解剖显微镜观察雄性胎鼠观察胎鼠外观及外生殖器形态畸形变化，同时测量体长、肛生殖距离(AGD)，检查吸收胎、活胎及晚死胎等，建成尿道下裂动物模型，对实验组畸形、未发现畸形的雄性胎鼠和对照组的生殖腺逐一确定性别并取材，对其生殖结节固定，再进行5μm连续组织横断切面，每200μm取出2张切片，HE染色后显微镜放大100～400倍拍照，确证雄性胎鼠尿道下裂畸形存在。 (2)先天性尿道下裂的病因学探讨：取得三个实验组和对照组所有孕鼠的全血，静置后离心，得到约1．5ml血清，用电化学发光法检测血清雄激素双氢睾酮(DHT)，检测敌敌畏染毒对孕鼠性激素水平的影响。 (3)有机磷农药的发育生殖毒性的研究：有机磷农药-敌敌畏的三个实验组和生理盐水对照组的雄性胎鼠的生殖腺及尿生殖结节固定包埋，明确阴茎方向后，垂直阴茎纵轴连续切片中，每200μm取出6张连片及各实验组临产雄性胎鼠性腺-睾丸包埋固定后分别切片，均行相应的免疫组化方法检测，探索激素ER，AR，LH，激素代谢酶AROM，增殖PCNA，凋亡因子CASEPASE-3在尿道周围组织及睾丸组织细胞中表达有无差异，以了解有机磷农药的作用机制。 结果： (1)生理盐水灌胃对照组未有雄性尿道下裂畸形胎鼠发生，敌敌畏5mg/kg/d、1．25 mg/kg/d和0.625 mg/kg/d三个剂量组均诱导出仔代尿道下裂畸形，发生率分别为57.1％、33％和20.8％；敌敌畏各剂量组都有缩短临产雄性胎鼠肛生殖距(AGD)的作用(P<0.05)；敌敌畏各剂量组可以明显降低雄性胎鼠的体重(P<0.01)。对每组胎鼠均行解剖并确认性别，避免误判。实验组雄性尿道下裂胎鼠及对照组雄性胎鼠的阴茎进行连续组织切片，每200μm取出1张切片，HE染色照相，同距离切片对比能清楚看出尿道下裂胎鼠的阴茎腹侧尿道沟敞开，包皮缺损较对照组明显长而宽。 (2)电化学发光法测定临产孕鼠血清内的雄激素DHT，敌敌畏高中低剂量实验组的DHT浓度较对照明显降低(P<0.01)，而敌敌畏各剂量组之间无统计差别(P>0.05)。 (3)免疫组化：PCNA：对照组尿道表达较DDVP明显，标明正常尿道粘膜增生更明显；睾丸，实验组与对照组无差别，均为曲细精管内精母细胞增生明显，核兰。Caspase-3：DDVP组尿道及睾丸表达均较对照略明显。提示尿道上皮凋亡活动增强，尿道发育受到影响，睾丸内leydig细胞和精母细胞凋亡增加，睾酮(T)的生成减少，相应生理过程受限。AR：对照组的尿道和睾丸内的表达均比DDVP组明显增强，表明DDVP组尿道和睾丸内的AR 下调，依赖雄激素的尿道发育生精过程等都可能会受到影响。ER：DDVP组与对照组间尿道和睾丸表达差别不明显，表明ER相关过程受干扰不明显。LHβ：DDVP组与对照组间尿道和睾丸表达差别不明显，提示LH β相关过程受干扰不明显。AROM：实验组与对照组间尿道和睾丸表达差别不明显，表明此两个部位的激素转化过程未受到明显影响。 结论： 1、成功建立尿道下裂大鼠模型，符合国际发育生殖毒性实验的规范，可成为进一步研究的基础。2、国际上首次发现有机磷类农药DDVP能类似雌激素诱导出哺乳动物先天性尿道下裂畸形并用连续切片确证：DDVP有减轻雄性胎鼠体重和缩短AGD的作用。3、敌敌畏能降低孕鼠血清激素DHT水平，可能干扰雄性胎鼠体内雄激素水平。4、DDVP对雄性胎鼠的尿道、睾丸AR有下调作用，这与尿道凋亡活动及胎睾内免疫组化发现leydig细胞凋亡(Caspase-3表达增强)增加相吻合，也与DDVP尿道增生活动明显弱于对照组相吻合(DDVP组尿道PCNA表达减弱)。5、在DDVP诱导哺乳动物发育生殖毒性的过程中，ER、LH β和AROM在两组尿道和睾丸内的表达无明显差别，提示可能与ER、LHβ和AROM的作用关系不密切。具体机制还需在此研究基础上，深入探索。 综上所述，广泛使用的有机磷农药能明确诱导哺乳动物先天性尿道下裂畸形，并干扰母鼠的激素水平，对雄性仔鼠可确定具有泌尿发育及生殖毒性，敌敌畏可能是一种被忽略的环境内分泌干扰物质，具有雌性化作用，是人类先天性尿道下裂畸形发病率及生殖损伤增加的可能原因之一。目前，还有诸多未明之处有待进一步的深入研究。

目录

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摘要

前 言

第一部分 敌敌畏诱导尿道下裂大鼠模型的建立与模型的确证

第二部分 有机磷农药-敌敌畏对孕鼠性激素的影响

第三部分 敌敌畏的泌尿发育生殖毒性的机制研究

综述

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