磁性附着体模拟静磁场对成骨细胞生物学效应的基础研究

摘要

脉冲电磁场(pulsed electromagnetic fields,PEMF)作为促进骨修复的一种方法已广泛应用于临床达20多年，其促进骨折愈合的疗效已得到国内外的证实。然而其作用机制是磁场效应占主导还是电场效应为主，直至目前尚未阐明。静磁场(static magnetic fields,SMF)做为一种良好的力源为修复体提供辅助固位和作为正畸矫治力矫治错合畸形，且体积小，无外设电源，便于长期局部应用，因而正被广泛应用于口腔修复和正畸领域。最近的研究表明静磁场能促进新骨形成、预防种植体植入导致的骨密度降低以及促进牙槽骨改建。然而有关静磁场对骨组织的生物学效应尚未取得一致结论，静磁场对成骨细胞(osteoblasts)增殖、分化以及代谢的影响和作用机制，尚鲜见研究报道。因此，有必要对磁性附着体静磁场对骨组织的影响作深入研究。 一．研究目的 本课题旨在通过模拟Magnetic 800磁性附着体静磁场，对体外培养的SD大鼠成骨细胞进行三种强度(12.5mT、125mT和250mT)、持续不同时间的静磁场加载，通过对细胞形态和表面超微结构观察、增殖活力和细胞周期分布及凋亡分析、ALP和OCN活性测定、TGF-β<,1>mRNA的合成以及原癌基因c-jun表达的测定，从细胞、亚细胞、分子及基因水平上研究磁性附着体静磁场对成骨细胞形态、增殖、分化和代谢的影响，探讨静磁场对骨组织的影响，从而为磁性附着体的临床应用提供可靠的实验依据。 二．研究方法 1．对成骨细胞进行静磁场加载，通过倒置相差显微镜观察活细胞形态，HE染色光镜观察以及扫描电子显微镜观察细胞表面超微结构，研究静磁场对成骨细胞形态的影响，并探讨其影响机理。 2．对成骨细胞进行静磁场加载，通过MTT比色法检测细胞增殖活力，流式细胞术分析细胞周期分布，细胞凋亡分析。研究静磁场对成骨细胞增殖特性的影响。 3．对成骨细胞进行静磁场加载，通过酶联免疫技术测定碱性磷酸酶活性，放射免疫技术检测骨钙素的合成，探讨静磁场对成骨细胞合成矿化蛋白的影响。 4．静磁场加载成骨细胞，采用荧光定量逆转录聚合酶链技术检测TGF-β<,1>mRNA的表达水平，从基因水平研究静磁场对成骨细胞合成细胞因子的影响。 5．静磁场加载成骨细胞，利用荧光定量PCR技术结合免疫组化技术，检测立即早期基因c-jun mRNA以及表达产物的变化，从蛋白水平和基因水平，探讨静磁场影响成骨细胞的作用机制。 三．结果 1．三种不同静磁场强度持续加载成骨细胞1到7天，细胞生长状态良好，均未观察到静磁场对细胞形态、排列及分布的影响。125mT和250mT静磁场加载3天，两磁场处理组细胞表面微绒毛增多，并且融合形成微囊泡，加载5和7天后，细胞表面微囊泡数目增多，．形成较大微囊泡，还可见囊泡的破裂。12.5moT静磁场持续加载5天和7天后，细胞表面出现较多的微囊泡。 2．三种不同静磁场强度持续加载成骨细胞1到7天，对细胞增殖无明显促进作用，各组细胞生长趋势基本一致，无明显的剂量一效应、时间一效应关系。各磁场组对细胞的各周期分布、增殖指数及细胞凋亡率无明显影响。 3．静磁场加载1天，各磁场组对碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性无明显。静磁场加载3天，125mT和25mT磁场组ALP活性增强；静磁场加载5天和7天，12.5mT、125mT和250mT各磁场强度组ALP活性明显升高；而且125mT和250mT磁场组ALP活性明显高于12.5mT；磁场组。持续静磁场作用会增加ALP活性，存在时间一效应关系。静磁场加载1天和3天，对成骨细胞分泌骨钙素(Osteocalcin,OCN)无明显影响；静磁场持续作用5天和7天，各磁场强度组骨钙素分泌明显增强，不同磁场强度之间骨钙素分泌无明显差别，无明显剂量一效应关系。 4．在整个观察期内，静磁场抑制TGF-β<,1>mRNA表达水平的下降。125mtT和250mT磁场加载组细胞的FGF-β<,1>tmRNA的表达水平，在各时段都明显高于对照组和12.5mT磁场加载组相应时间段；12,5mT磁场加载组在加载12小时、1天和3天，细胞的TGF-β<,1>mRNA的表达增强。 5．在整个观察期内，各磁场加载组细胞内c-jun mRNA和蛋白产物的表达呈二过性升高：12.5mT磁场加载组加载6和12小时，c-jUnmRNA和蛋白产物的表达明显升高，以后逐渐下降；125mT和250mT磁场加载组从加载2小时开始c-jun mRNA和蛋白产物的表达立即显著升高，且分别持续到6小时和12小时，明显高于对照组和12.5mT组。呈现一定的剂量一效应关系。 四．结论 磁性附着体模拟静磁场对体外培养SD大鼠乳鼠成骨细胞的形态、排列、增殖活性，细胞周期分布及细胞凋亡率无明显影响，而静磁场能使细胞合成c-jun、TGF-β<,1>、ALP和OCN的功能发生改变。推测静磁场可能通过影响成骨细胞对c-jun的表达而影响启动序列中含有AP-1结合位点的基因如TGF-β<,1>、ALP和OCN等的表达，刺激其表达升高，进而影响成骨细胞的分化，代谢和成熟。然而静磁场对成骨细胞影响的分子作用机制以及静磁场对骨组织的长期影响还有待于进一步深入研究。

目录

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英文缩略词表

前 言

第一部分磁性附着体模拟静磁场对成骨细胞形态的影响

第二部分磁性附着体模拟静磁场对成骨细胞增殖特性的影响

第三部分磁性附着体模拟静磁场对成骨细胞分化功能的影响

第四部分磁性附着体模拟静磁场对成骨细胞转化生长因子TGF-β1mRNA表达的影响

第五部分磁性附着体模拟静磁场对成骨细胞立即早期基因c-jun表达的影响

全文总结

参考文献

磁场对骨组织的生物学效应（文献综述）

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