抗纤溶酶抗体在抗磷脂综合征发病机制中的作用

摘要

目的:研究用纤溶酶免疫获得的抗纤溶酶抗体是否可以结合其他抗磷脂抗体相关的自身抗原以及抗纤溶酶抗体的致病性。方法：用天然的人纤溶酶免疫小鼠，获得免疫的小鼠血清和制备并纯化出10株抗纤溶酶单克隆抗体，用固相酶联免疫吸附(ELISA)法检测免疫小鼠血清及单抗对纤溶酶、心磷脂、p2糖蛋白I、活化蛋白C、凝血酶和组织型纤溶酶原活化物(t-PA)的识别，检测了单抗对凝血时间的影响。单抗5E9和5C5用于诱导BALB／c小鼠的流产模型，用抗C3b／C3c抗体行免疫组化检测活化补体对胎盘的损伤作用。结果用纤溶酶免疫获得的10份小鼠血清中，可以识别纤溶酶(10／10)、心磷脂(5／10)、p2糖蛋白I(7／10)、活化蛋白C(6／10)、凝血酶(3／10)和组织型纤溶酶原激活剂(5／10)。在所有的10株单克隆抗纤溶酶抗体中，1株与p2糖蛋白I和凝血酶，1株结合活化蛋白C，1株结合t-PA，在胎牛血清封闭的心磷脂检测实验中有三株对心磷脂有结合能力。单抗5E9能延长部分凝血活酶(APTT)时间，并被dRVVT试验所矫正，呈现狼疮抗凝物特性；5C5和5F10能降低纤溶酶的水解活性。在体内实验中，单抗5E9和5C5能增加孕鼠的死胎率，5E9和5C5单抗均能降低小鼠的胎盘和胎鼠的重量，免疫组化显示了这两株抗纤溶酶抗体处理后的小鼠胎盘的绒毛膜和蜕膜的问质血管有活化的补体C3沉积。结论纤溶酶是一种新的抗磷脂抗体的靶抗原，纤溶酶可能与其他参与凝血和纤溶的分子存在共同抗原表位，导致了抗纤溶酶抗体与p2糖蛋白I、活化蛋白C、凝血酶和t-PA之间的交叉反应。本文提示抗纤溶酶抗体在体内、外均可促进血栓的形成，且发病过程有补体活化途径参与。 第二章 抗纤溶酶抗体识别抗原的结构域的研究 印迹法检测了病人来源的单克隆抗体CLl5和多抗血清对不同结构域的识别。结果成功克隆了纤溶酶的6个结构域，并获得纯化的原核表达蛋白质。其中5个Kringle结构域获得可溶性表达，SPD为包含体表达。CLl5和24.1％(13／54)病人多抗主要识别的结构域是SPD。结论原核表达并纯化表达了6个纤溶酶结构域，并证实APS病人中的自身抗体主要识别SPD结构域。 第三章 抗纤溶酶抗体表位的生物信息学分析 目的:运用生物信息学和计算机辅助设计分析高亲和力抗纤溶酶单抗CLl5的表位，并鉴定其所识别的主要表位肽。方法根据CLl5的抗体的抗原决定簇CDR区的已知序列，在PBD蛋白库中进行同源比较，获得了同源性较高的单抗1MFA的Fab段的晶状结构，用计算机软件把CLl5的CDR区序列优化进入1MFA后，根据结构域的空间结构与CLl5进行对接。获得CLl5和纤溶酶丝氨酸蛋白酶结构域(serineprotease domain，SPD)的相互作用的结构，并计算它们之间的相互作用能量，结合已知的信息和对SPD的表位预测结果，设计了3段在酶活性中心附近的抗原表位肽。并检测了单抗对表位肽的结合能力和多肽对CLl5结合纤溶酶的抑制效应。结果通过对CLl5的晶体结构的同源模建，计算机模拟与SPD结合，CLl5在纤溶酶的酶活性区的606～789中的部分氨基酸序列有明显的相互作用，存在表位为空间构象，能将纤溶酶的SPD活性中心屏蔽。在对所设计的表位肽A629-644的结合试验中，CLl5能结合该肽，并且合成肽能部分抑制CLl5与纤溶酶的结合。结论生物信息学的方法是进行表位分析的有力手段。单抗CLl5的结合主要表位在纤溶酶的丝氨酸的活性中心区域附近，能阻断或影响丝氨酸蛋白酶的活性中心的关键氨基酸，降低纤溶酶的活性，可能是最终导致抗磷脂综合征病人血栓形成的原因之一。 目的:建立CLl5识别的肽抗原检测抗纤溶酶抗体的检测方法，在APS病人中检测抗纤溶酶抗体和抗纤溶酶单克隆抗体CLl5识别的肽抗原抗体，比较这两种检测方法的相关性，初步评估抗CLl5识别的肽抗原抗体的临床意义。方法收集了自2002年以来在我院就诊的54例APS病人，并收集了25例正常人和28例SLE患者作为对照，用ELISA方法检测了抗纤溶酶抗体、抗合成肽抗原抗体、抗心磷脂抗体和抗β 2糖蛋白1抗体，分析了以天然纤溶酶包被的抗纤溶酶抗体和基于单抗CLl5识别的合成肽抗原包被的抗纤溶酶抗体的ELISA检测两种方法的相关性。结果37％(20／54)的APS病人有IgG型抗纤溶酶抗体，31.5％(17／54)的病人存在IgG型抗合成肽抗体，较对照组有显著差异(P

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文摘

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论文说明：符号说明

前言

第一章 纤溶酶诱导抗磷脂抗体及其致病性的研究

第二章鉴别APS病人坑纤溶酶抗体识别的结构域

第三章高亲和力单克隆抗纤溶酶抗体CL15表位的生物信息学分析

第四章抗CL15识别的肽抗原体检测的方法的建立

参考文献

附件一：综述抗磷脂抗体综合征的发病机制研究进展

致谢

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