共培养诱导小鼠胚胎干细胞向软骨细胞分化的初步研究

摘要

目的:探讨软骨共培养体系诱导小鼠ES细胞向软骨细胞分化的可行性。 方法:实验使用两种不同的小鼠胚胎干细胞(ES cell)细胞株(E7及R1)。在第一部分，绿色荧光蛋白(GFP)标记的E7 ES细胞初步分化，得到第4天胚体(EB)。将EB消化为单个细胞后，同猪关节软骨细胞按一定比例(1: 3)混合后接种于聚乳酸一聚经基乙酸复合生物材料(PLGA)，经短期体外培养后植入裸鼠皮下7周取材。对照组为单纯EB细胞接种组。取材检测标本内软骨形成情况及EB细胞的转归。实验第二部分，分为休内部分实验及体外实验部分。体内实验中，将R1 ES细胞第4天胚体(EB)消化得到的单个细胞，经过流式细胞仪分选后得到Flk-1阳性细胞及Flk-1阴性细胞。实验组为Flk-1阳性细胞同猪关节软骨细胞按一定比例(1: 3)混合后接种于聚乳酸一经基乙酸复合生物材料(PLGA), Flk-1阴性细胞及未分选细胞同猪软骨细胞混合后植入作为对照组。取材后行连续切片，切片分别做1E染色、藏红花染色、荧光拍照、抗二型胶原(anti-human collagen 11)免疫荧光染色及抗小鼠主要组织相容性抗原(anti-mouseMHC)免疫荧光染色。前两种染色主要是显示标本内软骨生成情况，后两种染色主要显示软骨组织来源。体外实验中，将分选后的Flk-1阳性细胞离心后形成小球(pellet)，分别用软骨条件培养液及软骨诱导液培养4周。对照组为F1k-1阴性细胞及未分选细胞制作成小球，用同样的方法培养4周。检测方法包括HE染色及抗二型胶原(anti-human collagen II)免疫荧光染色，检测标本内软骨生成情况。 结果：实验第一部分的结果显示：实验组形成软骨组织和畸胎瘤的混合体。甲苯胺蓝染色、HE染色结果和荧光照片及anti-mouse MHC免疫荧光照片结果对照后显示，标本内部分软骨细胞由小鼠ES细胞分化而来。对照组单纯EB细胞接种后形成畸胎瘤，很少有软骨组织生成；实验第二部分体内实验的结果显示：实验组Flk-1阳性细胞同软骨细胞共培养，得到的标本大体观为白色透明的软骨组织。未见畸胎瘤形成。染色结果显示，除了少量的成纤维样细胞构成的松散组织，标本内主要由软骨组织构成。anti-mouse MHC免疫荧光染色显示，标本内部分软骨细胞来自小鼠ES细胞。对照组F1k-1阴性细胞同软骨细胞共培养，得到软骨组织同畸胎瘤的混合体。标本内软骨细胞少有anti-mouse MHC免疫荧光染色阳性。另外一对照组未分选细胞同软骨细胞共培养，标本大体观为白色透明的软骨组织，未见畸胎瘤形成。内主要由软骨组织构成，有少量软骨细胞anti-mouse MHC免疫荧光染色阳性。第二部分的体外实验显示，F1k-1阳性细胞形成的小球，在软骨条件培养液、或软骨诱导液的诱导作用下，分泌基质旺盛，并形成软骨陷窝结构。Flk-1阴性细胞在相同的培养体系内，形成杂乱的成纤维样结构。未分选的EB细胞形成软骨样结构同成纤维样结构的混合体。 结论：软骨细胞共培养体系，使用于E7细胞系时，虽然不能使小鼠EB细胞全部向软骨细胞分化，但可以诱导部分EB细胞向软骨细胞分化，使畸胎瘤中软骨组织成分增多。这一体系使用于R1细胞系时，联合使用FACS细胞分选方法，能够诱导Flk-1阳性EB细胞形成较纯的软骨组织。在体外小球培养实验中，软骨细胞条件培养液能够诱导Flk-1阳性EB细胞向软骨细胞分化。

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引言

第一章 共培养诱导小鼠E-7 ES细胞向软骨细胞分化摘要

第一章 共培养诱导小鼠E-7 ES细胞向软骨细胞分化 第一节：绿色荧光蛋白(GFP)转染E-7小鼠ES细胞

第一章 共培养诱导小鼠E-7 ES细胞向软骨细胞分化 第二节：共培养诱导小鼠GFP-E7 ES细胞向软骨细胞分化

第二章 共培养诱导小鼠R1 ES细胞向软骨细胞分化摘要

第二章 共培养诱导小鼠R1 ES细胞向软骨细胞分化第一节 共培养诱导小鼠R1ES细胞向软骨细胞分化

第二章 共培养诱导小鼠R1 ES细胞向软骨细胞分化第二节 小球培养法体外诱导R1ES细胞软骨分化

第二章 共培养诱导小鼠R1 ES细胞向软骨细胞分化第三节 讨论

参考文献

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