鱼露中章鱼胺的分离及其生物合成的研究

摘要

章鱼胺（Octopamine）是一种重要的生物胺和神经介质，起广泛的生理作用，有调节代谢与能量平衡的功效，是目前唯一商品化的防治肥胖症与糖尿病的β3-肾上腺素能受体激动剂。枳实和鱼露是天然章鱼胺的主要来源，但枳实中章鱼胺的含量仅为0．01～0．03％。而鱼露中相对丰富的章鱼胺的含量，使从鱼露中提取章鱼胺开发健康产品成为可能。本论文研究之一是从鱼露中提取章鱼胺的有效方法并使处理过的鱼露有望成为适合更广大人群的新的调味料，为进一步改进鱼露的生产工艺与开发利用鱼露打下了基础。研究之二是模拟鱼露中章鱼胺的生成路径，以酪胺为前体化合物，经细胞色素P450酶系的羟化作用，生物合成章鱼胺，从而为章鱼胺的工业化生产提供实验依据。 1．鱼露中章鱼胺的分离 鱼露含盐量达27％，章鱼胺是以有机酸盐的形式存在于鱼露。实验初期建立起快速准确测定章鱼胺的含量方法-HPLC方法。通过绘制标准曲线，以章鱼胺的进样浓度（μg·mL-1）为横坐标，峰面积为纵坐标，其回归方程为：Y=2868．4X+60．619，r=0．9991．结果表明：章鱼胺在0．0057-50μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。接着采用静态吸附和动态吸附相结合的方法，综合考虑吸附量、解吸率等因素，研究树脂分离提取鱼露中章鱼胺的吸附性能和洗脱参数。结果表明：H103大孔吸附树脂对鱼露中章鱼胺有较好的吸附分离效果，该树脂对鱼露中章鱼胺的静态饱和吸附量达2．925mg·g-1（干树脂），30％的乙醇为最佳洗脱剂，洗脱率达98．04％。H103大孔吸附树脂处理后，能有效分离章鱼胺，改善了鱼露的风味，适用于从鱼露中提取章鱼胺的工业应用。 2．章鱼胺的生物合成 鱼露在漫长的发酵过程中，细胞色素P450酶系（cytochrome P450s，CYP450）对章鱼胺的生物合成起了关键的作用。参照鱼露中章鱼胺的生成路径，以酪胺为前体化合物，经细胞色素P450酶系的催化羟化，转化为章鱼胺。细胞色素P450酶系催化作用的重要场所——肝脏，本论文采用改良的Omura法制备新鲜鱼肝制剂，减少肝脏里CYP450的失活率。CYP450的来源设计了三种方案，一是新鲜鱼肝经均质后的肝匀浆，二是肝匀浆再经高速离心和过滤后而得的S-9部分，第三是在S-9中再添加维生素C。三种方案后催化羟化产物经HPLC进行检测分析（章鱼胺为内标），以转化后章鱼胺的峰面积情况为指标，优化出最佳生物合成方案。结果表明：酪胺用肝匀浆和S-9生物转化章鱼胺后，HPLC图谱显示章鱼胺的峰面积很小，有并肩峰，且杂峰干扰大。随着转化时间延长，三小时后产物比一小时更多，且章鱼胺的峰面积减少，有分解趋势。S-9与维生素C耦合作用一小时后，HPLC图谱显示酪胺转化成章鱼胺的峰面积最多，无并肩峰，杂峰干扰很小，生物合成效果最好。三小时后章鱼胺的峰面积减少，也有分解的趋势，且其他产物增多，有杂峰干扰，这对今后分离造成困难。 由于国内目前尚未有β3-肾上腺素能受体激动剂——章鱼胺的研究报告或产品，本课题很有可能是第一个国内有关天然β3-肾上腺素能受体激动剂的生产和应用研究的课题。鱼露在中国的东南沿海乃至整个东南亚是水产加工链上重要的一环，由于极高的含盐量使进一步利用十分困难。笔者在调研中发现业者强烈希望鱼露产业有一个突破，产生较高的经济效益，但高含盐量使传统研究难以奏效。以鱼露为原料研究有效成分的分离，研究从鱼露中提取章鱼胺的有效方法，为章鱼胺的工业化生产提供实验依据。并使处理过的鱼露有望成为适合更广大人群的新的调味料，对传统鱼露产业的提升与开发海洋活性成分的研究，是一种有益的尝试。

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引言

第一章 章鱼胺分析方法的建立及评价

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1.1.仪器

1.2.样品

1.3.试剂

1.4.HPLC法测定章鱼胺的含量

2.结果

2.1.线性关系的考察

2.2.样品测定

2.3.鱼露样品中章鱼胺和酪胺含量的测定

第二章 鱼露中章鱼胺的分离

1.材料与方法

1.1.树脂的预处理

1.2.静态吸附性能考察

1.3.动态吸附性能考察

2.结果与分析

2.1.不同树脂对章鱼胺乙酸盐的静态吸附实验

2.2.两种树脂对鱼露中章鱼胺的静态吸附实验

2.3.洗脱剂的选择

2.4.H103 树脂对鱼露中章鱼胺动态吸附性能的研究

2.5.H103 树脂对鱼露的动态洗脱实验

2.6.H103 树脂的再生

2.7.H103 树脂处理后感官评定

3.讨论

第三章 章鱼胺的生物合成实验

1.材料与方法

1.1.实验材料

1.2.仪器

1.3.实验方法

2.结果与分析

2.1.缓冲液的选择

2.2.生物合成实验结果

3.讨论

小结

参考文献

致谢