金属离子对黄原胶发酵生物合成的影响

摘要

黄原胶（Xanthan Gum）是由野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）以碳水化合物为主要底物发酵产生的一种酸性胞外多糖。 本论文通过添加不同浓度金属离子的一系列摇瓶及发酵实验，对黄原胶生物合成途径，包括糖酵解（EMP）、磷酸戊糖途径（HMP）、2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸途径（ED）中关键酶的活性进行了研究，包括EMP途径中的丙酮酸激酶，（PYK）及HMP途径中的6-磷酸葡萄糖脱氢酶，（G-6-PDH），为黄原胶发酵提供了酶学证据。此外，通过对发酵过程中另外一些菌体代谢信息，包括残糖、氨氮的测定，结合酶活性研究，为进一步优化黄原胶发酵生产工艺提供理论指导意义，另一个重要目的是通过比较摇瓶发酵及罐发酵这两种不同发酵工艺的实验结果，得出它们之间的相关联系及区别。 本文内容主要分为以下三个方面： 一、单因子影响下野油菜黄单胞菌生物合成黄原胶的酶学分析； 二、黄原胶生物合成过程中金属离子对残糖、氨氮的影响； 三、分析黄原胶合成途径的有机酸含量，得出它们与酶活之间的关系，优化代谢网络，为充分发挥野油菜黄单胞菌生物合成黄原胶代谢潜能提供理论依据。 实验结果如下： 一、在两种发酵方式中，G-6-PDH活性的变化趋势是24h处活性较低，36h出现反弹，48h大幅降低，60h处出现反弹，72h处降至最低点。PYK活性呈现总体上升趋势，在60h处略微下降随后继续上升，但和48h基本处于同一水平。 二、金属离子对黄原胶生物合成酶活性的改变起着重要的作用。Mg2+是糖代谢过程中许多酶发生作用的催化因子，Ca2+可促进微生物的生长，在黄原胶罐发酵过程中，0．40g/100mlMg2+和0．60g/100mlCa2+是G-6-PDH的激活剂，可以提高其活性，其中Ca2+影响最大，与对照组相比可提高其酶活5～7倍，而0．04g/100ml Mn2+存在时对PYK活性的提高明显。 三、在两种发酵方式中，发酵液残糖含量均呈下降趋势，且在60h以后变化不大，趋于平稳。在罐发酵实验中，0．6g/100ml的Ca2+可以提高碳源的利用率，而Mg2+和CO2+则相反，会降低其发酵过程中碳源的利用率。 四、黄原胶生物合成过程氨氮含量总体呈下降趋势，24h至36h较明显，36h至48h是一个平稳期，随后再次明显下降，60h至发酵结束变化不大。这与残糖变化趋势一致。0．04g/100mlMn2+及0．60g/100mlCa2+会在发酵后期提高其氮源的利用率，而添加0．0016g/100ml Co2+的氨氮含量略微升高，说明其降低了发酵中氮源的利用率。 五、比较摇瓶实验和罐实验结果得出，金属离子对黄原胶生物合成关键酶活性及残糖的影响在两种发酵方式中基本保持一致。所不同的体现在Mg2+和Co2+，前者在罐发酵过程中，发酵初期及末期G-6-PDH活性略低于对照组，而摇瓶实验中其对该酶活性的提高贯穿全程，后者在摇瓶实验中各个时间检测点都提高了残糖含量，而在罐发酵实验中该影响主要表现在60h之前，可能原因尚需进一步研究。 六、Mn2+、Co2+及Ca2+对丙酮酸及TCA循环中的丙酮酸、乳酸、α-酮戊二酸等提高均比较明显，Mg2+则仅对α-酮戊二酸提高明显，结合酶活测定结果可以推测Mg2+对黄原胶生物合成后期起一定促进作用，在前期作用不太明显。Co罐发酵液中丙酮酸含量有所提高，但Co2+对G-6-PDH及PYK活性的影响并不明显，可能还有其他途径生成丙酮酸。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 引言

1.1 野油菜黄单胞菌主要生物学特性

1.2 黄原胶(xanthan gum)的概述

1.2.1 黄原胶分子结构、性质及应用

1.2.2 国内外研究现状

1.3 黄原胶生物合成途径

1.4 代谢流通量分析

1.5 与本文研究的主要内容、目的和意义

第二章 材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验菌种

2.1.2 培养基配方

2.1.3 实验试剂

2.2 培养方法

2.2.1 种子培养

2.2.2 摇瓶培养

2.2.3 发酵罐培养

2.3 酶活测定方法

2.3.1 细胞破碎粗提液的制备

2.3.2 G-6-PDH的测定

2.3.3 丙酮酸激酶的测定

2.3.4 蛋白质测定方法

2.4 发酵过程参数的测定

2.4.1 残糖测定方法

2.4.2 氨氮的测定方法

2.4.3 发酵液PH的测定

2.5 金属离子溶液的制备

第三章 金属离子野油菜黄单胞菌发酵关键酶影响

3.1 摇瓶实验

3.1.1 镁离子

3.1.2 锰离子

3.1.3 钴离子

3.1.4 钙离子

3.2 罐发酵实验

3.2.1 不同金属离子对G-6-PDH活性的影响

3.2.2 不同金属离子对PYK活性的影响

3.2.3 不同金属离子对酶活性影响比较

3.3 结论

第四章 金属离子对黄原胶合成过程残糖、氨氮的分析

4.1 金属离子对黄原胶发酵残糖的影响

4.1.1 摇瓶实验

4.1.2 罐发酵实验

4.2 金属离子对黄原胶发酵氨氮的影响

4.2.1 罐发酵中金属离子对氨氮的影响

4.2.2 罐发酵中金属离子对氨氮的影响比较

4.3 结论

第五章 有机酸分析

5.1 发酵液中有机酸的测定方法

5.1.1 样品预处理

5.1.2 实验条件

5.1.3 有机酸标准色谱图

5.2 结果与讨论

5.2.1 有机酸组分的定性

5.2.2 金属离子对黄原胶发酵有机酸的影响

5.3 结论

第六章 结论

6.1 结论

6.2 不足之处

参考文献

附录

致谢