草鱼免疫细胞和免疫相关基因研究：自然杀伤细胞杀伤活性和溶菌酶mRNA的表达

摘要

传统治疗鱼病的方法面临着严峻的药物残留、环境破坏和食品安全的考验。为更好地了解营养支持和非营养性添加剂溶菌酶制品对草鱼免疫力维持的重要性和可能的防病、治病作用,进一步探讨草鱼的免疫机制和免疫调控机理,本论文重点研究自然杀伤细胞杀伤活性和溶菌酶 mRNA的表达,具体内容如下。
　　一、实验选取平均体质量(31.86±1.47)g的草鱼,随机分为2个试验组,对照组(CG)和饥饿组(SG),每组三个平行,饥饿处理15、30、45和60 d,测定饥饿对草鱼的生长指标、肌肉生化组成、血液生化指标、蛋白质代谢、机体自然杀伤(NK)细胞的杀伤活性、血清和肝胰脏中溶菌酶活性和血清中碱性磷酸酶活性的影响。
　　1、饥饿组肥满度、脏体比、肝体比显著低于对照组。随着饥饿时间的延长,草鱼肌肉中的水分含量逐渐增加,脂肪和蛋白质含量呈现降低趋势,脂肪含量在四个时期没有明显的差异(P>0.05),水分和蛋白质含量分别呈现差异性增加和降低的趋势。血清总蛋白在饥饿15 d时与对照组没有明显的差异(P>0.05),其后三个时期对照组显著高于饥饿组(P<0.05),但饥饿组后三个时期趋于稳定。
　　2、随着饥饿时间的延长,白蛋白、总胆固醇和甘油三脂含量在四个时期与对照组都有显著变化(P<0.05),饥饿组总体呈现先降低后升高再降低的波浪形变化。丙氨酸氨基转移酶活性15 d、60 d时与对照组没有明显的变化(P>0.05),在30 d时先降低,45 d时显著升高(P<0.05)。随着饥饿时间的延长,与对照组相比 RNA:DNA在肌肉中没有明显的差异(P>0.05),在肝胰脏中与对照组呈现显著性差异,随着时间的延长饥饿组呈现先降低后增高的趋势。
　　3、谷氨酸脱氢酶活性在肌肉中于饥饿15 d时与对照组没有明显差异(P<0.05),其后比对照组显著增加,随着时间的延长饥饿组谷氨酸脱氢酶活性呈现上升的趋势;在血清中15 d、45 d时与对照组没有明显的变化(P>0.05),在30 d、45 d时显著升高(P<0.05)。肝胰脏中谷氨酸脱氢酶活性在四个时期比对照组有显著的增加;与肌肉相比,肝胰脏和血清中谷氨酸脱氢酶活性是一种有效的反应蛋白质分解代谢的指标。
　　4、受饥饿胁迫的影响,草鱼自然杀伤性细胞在脾和头肾中的杀伤活性显著低于对照组(P<0.05)且不随着饥饿时间的延长发生显著性变化;随着饥饿时间的延长,血清和肝胰脏中溶菌酶呈现先升高后降低的趋势,血清碱性磷酸酶在饥饿15 d、45 d、60 d时显著低于对照组;饥饿组的碱性磷酸酶活性在饥饿30 d以后,维持恒定。相比较而言,自然杀伤细胞的杀伤活性在反映鱼类免疫状况时比溶菌酶和碱性磷酸酶可能更为灵敏。
　　总之,草鱼对体内贮能物质(蛋白质和脂肪)的动用并不是简单地与饥饿时间线性相关,而是出现周期性和阶段性起伏的变化;同时饥饿降低了鱼类的非特异免疫水平。
　　二、试验随机选取平均体质量为(6.93±0.27) g的草鱼,设置为5个试验组(D1、D2、D3、D4、D5),每个试验组5个平行,分别饲喂添加溶菌酶制品0,100,200,300和400 mg/kg的试验饲料。于试验进行30 d、45 d、60 d时采集头肾、脾、肠、肝胰脏,测定三个阶段下,饲用溶菌酶对草鱼生长指标、NK细胞杀伤活性、溶菌酶活性、c型和g型溶菌酶 mRNA的相对表达量的影响。
　　1、随着溶菌酶添加量的增加,特定生长率并未呈现显著性增加的趋势,在饲喂60 d时,D2和D3组与对照组无显著性的差异;在试验结束时 D3(200 mg/kg)组饵料系数显著低于其它各试验组。
　　2、在饲喂30 d时 D3(200 mg/kg) NK细胞头肾和脾中的杀伤活性显著高于对照组;随着饲喂时间的增加,高剂量的溶菌酶添加组提高了草鱼 NK细胞的杀伤活性。饲喂30 d时,溶菌酶活性在高剂量的添加组活性显著高于对照组,在饲喂45 d时与30 d基本相同(头肾除外);在饲喂60 d时随着添加量的增加呈现不变或降低的趋势(头肾除外)。NK细胞活性和溶菌酶活性与溶菌酶剂量、存在组织和作用的时间相关。
　　3、饲用溶菌酶制品对內源溶菌酶基因表达的影响因所在组织、基因型、饲喂时间的不同而不同;从基因型来说,g-type溶菌酶的表达量升幅较大,变化呈现一定的规律性,在实验结束时400mg/kg组有相对较高的表达量;c-type溶菌酶的表达水平在各阶段各组织差异较大。从作用组织来说,肝胰脏和肠的g-type溶菌酶相对表达量升幅较小,头肾和脾较大;从饲喂时间来说,45 d各基因组的表达量相对较低。
　　4、在转录水平上,饲用溶菌酶制品刺激了内源溶菌酶 mRNA的表达,在饲喂30 d时溶菌酶蛋白水平与 mRNA的表达水平一致,其后两个阶段各组织差异较大,出现了不同步的现象。
　　在该实验中,从草鱼生长、饲喂30 dNK细胞的杀伤活性和溶菌酶活性来看,200mg/kg是饲用溶菌酶较适宜的添加量。从饲喂45 d、60 d与 g型溶菌酶的表达水平和NK细胞杀伤活性来看,400mg/kg组为溶菌酶的适宜添加量。

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引 言

1 鱼类的免疫系统组成

2 自然杀伤细胞在水产中的应用

3 水产动物溶菌酶的研究现状

4 研究目的和意义

第一章 草鱼蛋白质和脂肪代谢对饥饿胁迫的响应

材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结语

第二章 饥饿胁迫对草鱼非特异免疫水平的影响

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 语

第三章 饲用溶菌酶对草鱼自然杀伤性细胞杀伤活性和溶菌酶活性的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第四章 饲用溶菌酶对草鱼 c 型和 g 型溶菌酶 mRNA 时空表达的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

结 论

参考文献

攻读学位期间发表论文情况

致谢