脊尾白虾与三疣梭子蟹微孢子虫病的病原和病理

摘要

江苏启东海水混养脊尾白虾与三疣梭子蟹发生“肌肉白化病”。本文首先利用三种显微技术对病原的外部形态和内部结构进行观察分析,初步确定其为两种不同微孢子虫,然后利用微孢子虫通用引物扩增SSU rRNA基因序列,对两种微孢子虫进一步进行分子鉴定,最后对脊尾白虾和三疣梭子蟹的病变组织进行了病理分析。结果如下:
　　脊尾白虾微孢子虫具包囊结构,包囊大小为5.4±0.55(4.4-6.6μm),一个包囊内含8个孢子,孢子呈椭圆形,成熟孢子新鲜状态下大小为2.3±0.25(1.7-2.8μm)×1.5±0.19(1.2-1.9μm),固定后大小为2.0±0.16(1.7-2.3μm)×1.3±0.15(0.96-1.6μm),孢内极丝一般环绕9～10圈,双排排列,核单个,形态结构特征与Thelohania属相似。克隆脊尾白虾微孢子虫核糖体 SSU-ITS-LSU(部分)基因获得的片段大小为1873bp。SSU rRNA基因系统发育分析表明其与Potaspora morhaphis亲缘关系最近,序列相似性91％,而Potaspora morhaphis与脊尾白虾微孢子虫形态差异明显。基于传统生物学分类与分子生物学分类冲突,将其归为未分类种 Microsporidium sp.。病理分析显示:脊尾白虾的鳃、胃、肠和肌肉内均发现微孢子虫寄生和不同程度的病变。其中,肌肉组织病变最严重:病虾的头胸甲、步足、腹部、尾扇等部位的肌肉均呈现白化症状,失去透明度,色泽如棉花般,原肌原纤维存在的空间被大量的球形包囊占据,肌原纤维断裂,空泡数量增多,线粒体消失。鳃细胞膨大呈空泡状,鳃膜坏死,核质、细胞质和细胞器消失。胃细胞胞浆基质电子密度增大,孢子寄生在结缔组织中脂滴附近。肠外膜上皮细胞核质皱缩,部分肌层消失,孢子寄生在肠粘膜层和肌层之间。
　　三疣梭子蟹微孢子虫无包囊包被,孢子外壁具有特殊的微绒毛结构,呈放射形,成熟孢子近似卵圆形,大小为1.8±0.11(1.6-2.1μm)×1.4±0.08(1.2-1.6μm),极丝9圈,单排规则排列,核单个,形态学性状与Ameson属特征相同。三疣梭子蟹微孢子虫核糖体SSU-ITS-LSU(部分)rRNA基因PCR扩增片段大小为1684bp, SSU rRNA基因系统发育研究表明其与Ameson属亲缘关系明显,形态特征分类与分子生物学分类一致,因此,确定其为Ameson sp.。病理分析显示:三疣梭子蟹的鳃、胃、肠和肌肉内均同样发现微孢子虫寄生和不同程度的病变。其中,肌肉组织病变最严重,病蟹大螯、各步足、游泳足内的肌肉明显呈白化状,失去透明度,肌细胞内大量微孢子虫孢子寄生,肌原纤维模糊,大部分消失,细胞核变形,异染色质浓缩,线粒体嵴断裂,消失。鳃上皮细胞坏死,线粒体水肿、嵴消失,细胞核核质边缘化,核解体消失,细胞质及细胞器消失,细胞失去典型细胞结构。胃中微孢子虫寄生导致细胞膜消失,成熟孢子、多数细胞器及细胞质被释放到细胞外环境中,染色质边聚。肠内细胞膜结构被微孢子虫破坏,细胞核周围溶酶体数量增加,核浓缩破碎甚至消失,细胞器消失,细胞空泡化。

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第一章 引 言

1.1 脊尾白虾与三疣梭子蟹养殖病害情况

1.1.1养殖现状

1.1.2脊尾白虾与三疣梭子蟹共患病病害情况

1.2微孢子虫研究概况

1.2.1微孢子虫孢子的形态结构

1.2.2微孢子虫的生活周期

1.2.3微孢子虫的细胞入侵机制

1.2.4微孢子虫在水生动物间的传播途径

1.2.5微孢子虫的分类

1.3研究目的及意义

第二章 脊尾白虾微孢子虫病的病原生物学和病理学研究

2.1 脊尾白虾微孢子虫的传统生物学研究

2.1.1材料

2.1.2方法

2.1.3结果

2.1.4讨论

2.2脊尾白虾微孢子虫的分子生物学研究

2.2.1材料和试剂

2.2.2方法

2.2.3结果

2.2.4 讨论

2.3脊尾白虾微孢子虫病的病理学研究

2.3.1材料

2.3. 2方法

2.3.3 结果

2.3.4讨论

第三章 三疣梭子蟹微孢子虫病原学和病理学研究

3.1三疣梭子蟹微孢子虫的传统生物学研究

3.1.1材料

3.1.2方法

3.1.3 结果

3.1.4讨论

3.2 三疣梭子蟹微孢子虫的分子生物学研究

3.2.1材料和试剂

3.2.2方法

3.2.3结果

3.2.4 讨论

3.3 三疣梭子蟹微孢子虫病的病理学研究

3.3.1材料

3.3.2方法

3.3.3结果

3.3.4讨论

结论

参考文献

附录

致谢