凡纳滨对虾热休克蛋白60、70和90与WSSV的相互作用

摘要

白斑综合征病毒(WSSV)已经给对虾养殖业带来了巨大的危害,造成了巨大的损失。为了了解其致病机制,本论文主要针对 HSP60、HSP70和HSP90与WSSV的相互作用进行研究,主要内容如下:
　　(1)为了研究凡纳滨对虾热休克蛋白60(HSP60)在WSSV感染中的作用,将其克隆至表达载体 pBAD/gⅢA中,构建的重组载体pBAD/gIIIA-HSP60转入到大肠杆菌Top10感受态细胞中,经L-阿拉伯糖诱导约4h后,采用SDS-PAGE及Western Blot分析,结果表明重组蛋白HSP60得到表达。经Co2+亲和层析纯化获得目的蛋白,制备HSP60的兔抗抗体,将抗体进行纯化测定效价。Far Western检测,ELISA和间接免疫荧光分析表明 HSP60与VP12、VP24、VP26、VP39、VP90有相互作用。将HSP60的抗体注射到对虾体内后再进行WSSV感染,通过计算累计死亡率观察到在WSSV感染的前期,抗体对对虾有一定保护作用。将HSP60注射入对虾体内再进行WSSV感染实验,通过累计死亡率的计算观测到 HSP60对对虾有一定的保护作用,并通过Real-Time PCR来检测感染后对虾的类淋巴、鳃内STAT基因的表达情况和鳃中的WSSV拷贝数,得知HSP60可能在WSSV感染的前期起到保护作用。
　　(2)为了研究凡纳滨对虾热休克蛋白70(HSP70)在WSSV感染中的作用,基于热休克蛋白的结构,将HSP70分为两段HSP70A和HSP70P,分别克隆至表达载体pBAD/gⅢA中,构建的重组载体转入到大肠杆菌Top10感受态细胞中,经L-阿拉伯糖诱导,采用SDS-PAGE及Western Blot分析,结果表明重组蛋白HSP70A和HSP70P得到表达。经Co2+亲和层析纯化获得目的蛋白。Far Western分析表明,HSP70A和 HSP70P与重组表达的VP24、VP26有相互作用,ELISA结果说明在设定浓度范围内,HSP70A和HSP70P与VP24、VP26的作用与浓度成正相关。间接免疫荧光分析表明,HSP70与VP24、VP26共定位于对虾血细胞上。VP24、VP26与HSP70作用降低HSP70的ATPase活性。该研究为深入研究HSP70在WSSV感染中的作用提供依据。
　　(3)为了研究凡纳滨对虾热休克蛋白90(HSP90)在WSSV感染中的作用,基于其自身的结构,将HSP90分为两段即HSP90N和HSP90P。分别将其克隆至表达载体pBAD/gⅢA中,构建的重组载体转入到大肠杆菌Top10感受态细胞中,经诱导后采用SDS-PAGE及Western Blot分析,结果表明重组蛋白HSP90N和HSP90C均得到表达。经Co2+亲和层析纯化获得目的蛋白,制备HSP90C的兔抗抗体,将抗体进行纯化测定效价。通过Far Western检测,证明HSP90C的抗体可以和HSP90N、HSP90C发生相互作用。ELISA反应和间接免疫荧光分析表明HSP90N和HSP90C与VP12、VP24、VP26、VP90之间有相互作用。将HSP90N和HSP90C进行中和实验,通过累计死亡率的计算观测到HSP90C对对虾有一定的保护作用,Real-Time PCR检测感染后对虾鳃中的WSSV拷贝数,表明HSP90C可能在WSSV感染的前期起到保护作用。
　　(4)采用Real-Time PCR技术分析WSSV感染凡纳滨对虾不同时段鳃、肠、肝胰腺、肌肉、类淋巴和血细胞组织中热休克蛋白 HSP60和HSP90基因mRNA转录水平的变化。结果显示,HSP60和HSP90在这六个组织中都有表达,WSSV感染影响各组织中HSP60和HSP90 mRNA转录水平的表达,WSSV感染抑制HSP60在鳃、肠、肌肉和血细胞的表达,促进HSP90在鳃、肠、肝胰腺、肌肉、血细胞和类淋巴的表达,表明HSP60和HSP90参与WSSV感染免疫反应。

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引言

第一章：文献综述

第一节：白斑综合征病毒简介

第二节：热休克蛋白的研究进展

第二章：凡纳滨对虾热休克蛋白60与WSSV的相互作用

第一节：HSP60的原核表达

第二节：HSP60抗体的制备与检测

第三节：HSP60与WSSV几种结构蛋白间的相互作用

第四节：HSP60在WSSV感染中的作用

第三章：凡纳滨对虾热休克蛋白70与VP24、VP26的相互作用

第一节：HSP70的原核表达

第二节：HSP70A、HSP70P与VP24、VP26的相互作用

第四章：凡纳滨对虾热休克蛋白90与WSSV的相互作用

第一节：HSP90的原核表达

第二节：HSP90抗体的制备与检测

第三节：HSP90与WSSV结构蛋白间的相互作用及其在感染时作用

第五章：WSSV感染对HSP60、HSP90表达的影响比较

总结

参考文献

附录

致谢