凡纳滨对虾造血激素、F1Fo-ATP合酶β亚基和WSSV-VP37的相互作用研究

摘要

白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是养殖对虾的主要病毒性病原之一，给对虾养殖业造成巨大经济损失。病毒感染是从病毒黏附蛋白与宿主表面受体相互作用开始的，因此研究病毒与宿主相互作用具有重要意义。在前期对WSSV与宿主相互作用蛋白的鉴定研究中，发现F1-ATP合酶β亚基可能以受体身份参与了WSSV的感染。Lin等发现F1-ATP合酶β亚基与造血激素（astakine，AST）存在特异性的结合作用。AST作为一种在甲壳动物中具有促进造血组织细胞分化和增殖的细胞因子，在太平洋蝲蛄中也被发现添加该蛋白可以促进WSSV在造血细胞中增殖。F1-ATP合酶β亚基（ATPsyn-β）和造血激素都与WSSV感染密切相关，为进一步了解两蛋白在功能上的相互关系，解析其与WSSV的粘附蛋白VP37之间作用机制。本文通过Far-Western、免疫荧光定位法、原子力技术等，分别从蛋白水平和细胞水平鉴定了AST、ATPsyn-β和VP37之间的相互作用关系，为探讨WSSV感染宿主的分子机制提供理论基础。
　　本研究共分为4部分：利用酶联免疫结合法、Far-Western技术及竞争结合法在蛋白水平上鉴定AST、ATPsyn-β和VP37之间的相互作用关系；利用实时荧光定量PCR和免疫荧光组织化学染色及细胞荧光免疫染色的方法对LvAST和ATPsyn-β进行组织分布和细胞定位分析；利用激光共聚焦显微镜，运用免疫荧光组织化学染色和细胞荧光免疫染色的方法在细胞水平上进行LvAST、ATPsyn-β和VP37、ATPsyn-β共定位及竞争抑制关系分析；利用原子力技术在纳米水平获取正常对虾血淋巴细胞及WSSV感染后细胞的形态变化并进行原子力显微镜探针标记及其对LvAST、VP37和ATPsyn-β的结合关系验证。
　　1.蛋白水平上LvAST、VP37、ATPsyn-β的结合活性分析：诱导表达并纯化LvAST、VP37和F1Fo-ATP synthase重组蛋白，运用ELISA结合实验、Far-Western的方法及竞争结合实验检测三蛋白的相互作用关系。研究结果表明，ATPsyn-β是LvAST和VP37共有的结合蛋白，而重组LvAST和VP37蛋白并不具有直接的结合作用；LvAST与VP37相互竞争抑制对方与ATPsyn-β的结合，并且这种竞争抑制作用与LvAST、VP37的蛋白量正相关。
　　2.LvAST和ATPsyn-β的组织分布和细胞定位分析：经实时荧光定量PCR检测表明LvAST在血淋巴细胞、肝胰腺、肌肉、淋巴器官和鳃中均有表达，与免疫荧光组织化学方法的检测结果相符；经荧光强度定量分析发现LvAST在肝胰腺和鳃中分布最多；经免疫荧光技术在细胞水平进一步检测LvAST在血淋巴细胞的分布，结果表明该蛋白不仅在血淋巴细胞内存在，并且在血淋巴细胞外膜上有分布；免疫荧光组织化学方法的检测ATPsyn-β也具有组织分布的广谱性，并在鳃和肝胰腺组织中中含量较高。
　　3.细胞水平上LvAST、VP37和ATPsyn-β的相互结合关系分析：利用激光共聚焦显微镜运用细胞荧光免疫和荧光免疫组织化学染色的方法分别在血淋巴细胞内，血淋巴细胞膜上和肝胰腺组织切片上对LvAST、ATPsyn-β和ATPsyn-β、VP37进行共定位和竞争作用分析。研究结果表明：三者在细胞水平和组织水平均具有空间分布的一致性，并且LvAST和VP37相互竞争与ATPsyn-β的结合，同时LvAST能够竞争抑制WSSV对ATPsyn-β的结合。
　　4.原子力显微镜获取对虾血淋巴细胞在正常及WSSV感染后的形态变化：
　　（1）利用原子力显微镜以AAC模式和MAC模式分别对空气中液体状态中的正常凡纳滨对虾血淋巴细胞进行表征扫描ATPsyn-β。并在AAC模式下对WSSV感染的血淋巴细胞进行表征扫描，以获取差异性特征信息。结果在MAC模式下扫描得到的血淋巴细胞可分为两类，A类细胞较大，平均大小为24×8μm，平均高度为531nm，B类细胞平均大小为16×14μm，平均高度为564nm；AAC模式下也可以扫描到两类大小不同的细胞，但细胞高度均有缩减，其中A类细胞平均高度为454nm，B类细胞平均高度为284nm。究其原因，可能是细胞干燥失水所致。这一结果为凡纳滨对虾血淋巴细胞的分类提供了一定的数据。在AAC模式下扫描WSSV感染的血淋巴细胞，发现细胞高度明显降低至283nm和208nm，并且细胞边界和内部结构变模糊。
　　（2）原子力显微镜探针标记及其对LvAST、VP37和ATPsyn-β的结合关系验证：对原子力显微镜进行探针标记，分别利用标记LvAST或VP37的探针，近一步验证三者的相互作用关系。
　　结论：LvAST和VP37分别与ATPsyn-β存在特异性的结合作用，但是VP37和LvAST不存在直接的结合关系，VP37和LvAST互相竞争对ATPsyn-β的结合。可以确定ATPsyn-β是VP37和astakine共同的结合蛋白。据此，我们推测WSSV可能和astakine竞争共同的受体，干扰细胞分化，进而导致宿主病变。本研究为进一步了解WSSV感染宿主的分子机制提供理论依据。

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前言

1 对虾白斑综合征病毒（WSSV）研究概况

2 F1Fo-ATP合酶的研究进展

3 虾造血激素的研究现状

4 展望

第一章蛋白水平上凡纳滨对虾造血激素（LvAST）、VP37和ATPsyn-β的结合性分析

1 菌种的诱导表达和纯化

2 三种蛋白的相互作用分析

3 LvAST、VP37对ATPsyn-β的竞争性结合分析

4 结果

5 讨论

第二章 凡纳滨对虾造血激素蛋白和ATPsyn-β的组织分布和细胞定位分析

1 材料和仪器

2 方法

3 结果

4 讨论

第三章 细胞水平上凡纳滨对虾造血激素（LvAST）、VP37和F1Fo-ATP合酶β亚基的结合活性分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四章 原子力显微镜检测凡纳滨对虾造血激素（LvAST）、VP37和F1Fo-ATP合酶β亚基的结合作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献